ARNm cis de PKD1 y PKD2 - Grupo de contador de dinero de Nantong

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 4765 (2022) Citar este artículo

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La enfermedad renal poliquística autosómica dominante (PQRAD), una de las afecciones genéticas humanas más comunes y una etiología frecuente de insuficiencia renal, es causada principalmente por mutaciones heterocigotas de PKD1. La formación de quistes renales ocurre cuando la dosis de PKD1 cae por debajo de un umbral crítico. Sin embargo, no existe ningún marco para aprovechar el alelo restante o revertir la disminución de PKD1. Aquí, mostramos que los ARNm producidos por el alelo PKD1 no inactivado se reprimen a través de su elemento de unión 3′-UTR miR-17. La eliminación de este motivo (Pkd1∆17) mejora la estabilidad del ARNm, aumenta los niveles de policistina-1 y alivia el crecimiento de quistes en modelos de PKD celular, ex vivo y de ratón. Sorprendentemente, Pkd2 también se inhibe a través de su motivo 3′-UTR miR-17, y la desrepresión de policistina-2 inducida por Pkd2∆17 retarda el crecimiento de quistes en modelos mutantes de Pkd1. Además, el bloqueo agudo de la inhibición cis de Pkd1/2, incluso después de la aparición del quiste, atenúa la PKD murina. Finalmente, el modelado de los alelos PKD1∆17 o PKD2∆17 en cultivos primarios de ADPKD derivados de pacientes conduce a quistes más pequeños, proliferación reducida, menor expresión de pCreb1 y potencial de membrana mitocondrial mejorado. Por lo tanto, evadir la interferencia cis 3′-UTR y mejorar la traducción del ARNm de PKD1/2 es un enfoque de detención de ADPKD potencialmente independiente de las mutaciones.

Se estima que 12,5 millones de personas en todo el mundo padecen poliquistosis renal autosómica dominante (PQRAD), lo que la convierte en una de las afecciones monogenéticas más comunes conocidas por la humanidad. Una característica clínica de la PQRAD es el crecimiento incesante de innumerables quistes llenos de líquido en los riñones, que reemplazan el parénquima normal y, durante décadas, causan un agrandamiento bilateral masivo de los riñones e insuficiencia renal1. La ADPKD se produce debido a mutaciones heterocigotas con pérdida de función en PKD1 (~78% de los casos) o PKD2 (~15% de los casos). La hipótesis clásica para la iniciación del quiste es que, además de una mutación que inactiva la línea germinal en un alelo del gen PKD, hay una inactivación somática (conocida como el segundo golpe) en el otro alelo, lo que provoca una pérdida completa de la expresión de policistina en la célula. . Sin embargo, en los últimos años, varias líneas de evidencia apoyan el umbral de dosis del gen como un mecanismo implicado en la cistogénesis2,3. Esta hipótesis postula que la pérdida completa de PKD1 no es necesaria, sino que se produce cistogénesis si la dosis funcional de PKD1 cae por debajo de un umbral crítico. En apoyo del modelo de dosificación genética, la inactivación de la mutación del segundo impacto no es una característica universal, especialmente en quistes más pequeños de PQRAD4,5,6,7. Es importante destacar que muchos individuos con PQRAD continúan teniendo expresión residual de PC1 porque portan mutaciones sin sentido (en lugar de inactivadoras) de PKD1 en la línea germinal8,9,10. Como prueba de principio, reducir la dosis de Pkd1 es suficiente para producir PKD en ratones, cerdos y monos4,11,12,13,14,15,16. Por lo tanto, si una dosis reducida causa PQRAD, aumentar la expresión del alelo PKD1 normal podría detener el trastorno. Sin embargo, a pesar de este potencial transformador, los factores que rigen la dosis de PKD1 en la PQRAD se desconocen en su mayoría y, actualmente, no existen mecanismos para activar el alelo PKD1 normal.

La región 3′-no traducida (3′-UTR), la porción de ARNm que se encuentra inmediatamente aguas abajo del codón de terminación de la traducción, protege el ARNm de la degradación y facilita la traducción a través de su cola poli(A). Paradójicamente, la 3′-UTR, a través de la interacción con microARN (miARN), también puede mediar la represión o muerte de la traducción del ARNm18,19,20,21. La mayoría de las 3′-UTR de ARNm albergan elementos de unión a miARN (MBE) conservados evolutivamente, lo que implica que la inhibición cis de la traducción es un modo generalizado de regulación de la producción de genes22. Sin embargo, este aspecto intrigante de la función 3′-UTR está mal delineado. La predicción es que los MBE individuales tienen un impacto menor en la función del ARNm del huésped, considerando que los miARN actúan principalmente como reóstatos y reprimen modestamente los objetivos del ARNm. En contra de esta lógica predominante, razonamos que en determinadas circunstancias, como cuando la dosis del gen ya está reducida debido a una haploinsuficiencia, la inhibición cis del alelo restante mediada por MBE podría tener un efecto modificador de la enfermedad al regular la producción final de proteína.

Nuestro objetivo fue determinar si la desrepresión monoalélica de PKD1 es posible y cómo influye en la progresión preclínica de la PQRAD. PKD1 contiene un motivo de unión de miR-17 en su 3′-UTR, y la expresión y actividad de miR-17 son mayores en los modelos de ADPKD4,23,24,25,26. Por lo tanto, probamos la idea de que el ARNm de PKD1 está inhibido en cis por su motivo 3′-UTR miR-17, y el bloqueo de esta inhibición revierte la disminución de PKD1. Utilizamos la edición CRISPR/Cas9 para eliminar el motivo miR-17 del gen PKD1 en modelos monoalélicos de PQRAD. Descubrimos que eliminar el motivo miR-17 es suficiente para mejorar la estabilidad del ARNm de Pkd1, aumentar la expresión de policistina-1 (PC1) y mejorar el crecimiento de quistes en modelos de PKD celular, ex vivo y de ratón. El otro gen ADPKD, PKD2, también contiene un motivo de unión 3′-UTR miR-17; Sorprendentemente, la eliminación de este motivo miR-17 aumenta los niveles de policistina-2 (PC2) y atenúa el crecimiento de quistes en modelos mutantes Pkd1. Además, el bloqueo farmacéutico agudo de la inhibición cis de Pkd1/2 previene la aparición de quistes y estabiliza la PKD establecida en ratones. Finalmente, demostramos que la desrepresión de PKD1 o PKD2 revierte los eventos patógenos de quistes en los epitelios de quistes renales primarios derivados de individuos con ADPKD.

El impacto de los MBE 3′-UTR individuales en la regulación de los genes del huésped prácticamente no se ha estudiado. Exploramos la idea de que la represión cis a través de su motivo de unión 3′-UTR miR-17 es un mecanismo novedoso que rige la dosis de Pkd1. Comenzamos examinando el efecto de eliminar este MBE en riñones de ratón normales. Diseñamos sgRNA que se unen al exón-46 de Pkd1, flanqueando el segmento de ADN que codifica el motivo miR-17, y utilizamos la edición CRISPR/Cas9 para generar alelos de Pkd1 (Pkd1∆17) que carecen del sitio de unión de miR-17 (Fig. 1a). . Primero, validamos la eliminación del motivo mediante PCR de ADN seguida de secuenciación directa de Sanger (Fig. 1b, c). Nuestro enfoque de edición no inactivó inadvertidamente Pkd1 ya que observamos histología renal y función renal normales en ratones Pkd1∆17 / ∆17 de 6 y 18 semanas (Fig. 1d-f y Fig. 1 complementaria). Para evaluar los niveles de PC1, realizamos un análisis de transferencia Western utilizando el anticuerpo PC1 7E12, que detecta la proteína de longitud completa y el fragmento n-terminal. Primero validamos el anticuerpo 7E12 en células de tipo salvaje y Pkd1-/-. Como era de esperar, no observamos ninguna señal de PC1 en las células nulas de Pkd1 (Figura complementaria 2). A pesar de la pérdida del sitio de unión de miR-17, la expresión de PC1 fue la misma entre los riñones de ratones Pkd1∆17/∆17 de 6 o 18 semanas y sus respectivos ratones Pkd1+/+ de control de la misma edad ( Figura complementaria 1d), lo que implica que no hubo inhibición cis de Pkd1 en los riñones de ratones adultos normales.

a Ilustración gráfica del enfoque CRISPR/Cas9 utilizado para eliminar el motivo miR-17 de Pkd1 3′-UTR (Pkd1Δ17). b Productos de PCR obtenidos después de la amplificación del ADN de la cola de ratones con los genotipos indicados. La banda inferior representa la eliminación de Δ17. n = 3 para todos los genotipos. c Secuencia de nucleótidos 3′-UTR de los alelos de tipo salvaje (WT) y Pkd1Δ17. El motivo de unión de miR-17 y los sitios PAM de sgRNA están resaltados en negrita, verde y rosa, respectivamente. La línea discontinua rosa indica los nucleótidos eliminados en Pkd1Δ17. Se muestra el cromatograma de secuenciación de Sanger que representa la secuencia de nucleótidos del alelo Pkd1Δ17. d Tinción H&E, marcado con lectina Lotus Tetragonolobus (LTL, un marcador del túbulo proximal), inmunotinción con proteína Tamm-Horsfall (THP, un asa de Henle maker) y marcado con aglutinina Dolichos Biflorus (DBA, un marcador del conducto colector) que muestra una histología renal normal en Ratones Pkd1+/+ y Pkd1Δ17/Δ17 de 8 semanas de edad. e – f Niveles normales de peso renal con respecto al peso corporal (KW/BW) y nitrógeno ureico en sangre (BUN) en ratones Pkd1+/+ y Pkd1Δ17/Δ17 de 8 semanas de edad. Imágenes g – h y cuantificación del índice de quistes de riñones E13.5 Pkd1+/+, Pkd1Δ17/+ y Pkd1Δ17/Δ17 cultivados durante cuatro días en medios de cultivo que contienen vehículo, 100 uM de AMPc o 100 uM de AMPc más 250 uM de SAM. i Inmunotransferencias que representan la expresión de PC1 en riñones ex vivo Pkd1+/+, Pkd1Δ17/+ y Pkd1Δ17/Δ17 tratados con vehículo, AMPc o AMPc más SAM. La actina se utiliza como control de carga. j QRT-PCR específica de alelo que muestra la cantidad de ARNm de Pkd1 producidos por los alelos de tipo salvaje (+) y Δ17 en riñones E15.5 Pkd1Δ17/+ (n = 5). Las barras de error indican SEM. Análisis estadístico: Prueba t de Student de dos colas (e, f); ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey (h); Prueba t pareada de dos colas (j). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

De acuerdo con las observaciones de otros27, el análisis de nuestro conjunto de datos de microarrays de miARN reveló que los niveles de miR-17 disminuyen con la maduración posnatal (Figura complementaria 3). Por lo tanto, la falta de inhibición cis de Pkd1 en riñones maduros probablemente se deba a la baja actividad basal de miR-17. Por lo tanto, pasamos a analizar los riñones embrionarios (E) Pkd1∆17/+ y Pkd1∆17/∆17. Utilizamos cultivo de órganos renales ex vivo para evaluar simultáneamente el impacto en la expresión de Pkd1 y la cistogénesis. Cultivamos riñones de camada E13.5 Pkd1+/+, Pkd1∆17/+ y Pkd1∆17/∆17 durante cuatro días en medios que contienen 8-bromo-cAMP 100 μM o 8-bromo-cAMP 100 μM más S-adenosilmetionina ( SAM), o control del vehículo (Fig. 1g, h). Como se esperaba28, el AMPc aumentó la formación de quistes en los riñones Pkd1+/+ en comparación con el tratamiento con vehículo, y este efecto se incrementó aún más con la adición de SAM. Curiosamente, el efecto procistogénico de AMPc y SAM se atenuó en los riñones Pkd1∆17/+ y Pkd1∆17/∆17 (Fig. 1g, h). Además, observamos una mayor expresión de PC1 en Pkd1∆17/+ y Pkd1∆17/∆17 en comparación con los riñones cultivados ex vivo de Pkd1+/+ mediante análisis de inmunotransferencia (Fig. 1i). Estos datos indican que la eliminación del motivo miR-17 desreprime PC1 y bloquea el efecto procistogénico del AMPc en riñones embrionarios cultivados.

A continuación, medimos la abundancia relativa de transcripciones de tipo salvaje y ∆17 dentro del conjunto total de ARNm de Pkd1. Diseñamos cebadores específicos de alelo aprovechando la secuencia única de ARNm creada mediante la edición CRISPR/Cas9 del alelo ∆17. qRT-PCR reveló que en los riñones heterocigotos E15.5 in vivo Pkd1∆17/+, el alelo ∆17 contribuyó con casi un 50% más de transcripciones que su contraparte de tipo salvaje (Fig. 1j). De manera similar, observamos que el alelo ∆17 produjo más ARNm de Pkd1 que el alelo de tipo salvaje en cultivos de riñón Pkd1∆17/+ ex vivo. Esta diferencia se volvió aún más pronunciada en presencia de AMPc (Figuras complementarias 4a-c). Estas observaciones implican además una inhibición de los ARNm de Pkd1 de tipo salvaje por miR-17, pero una evasión de la represión y una estabilidad mejorada de los ARNm de Pkd1∆17 en riñones embrionarios.

La formación de quistes renales se produce cuando la dosis de PKD1 cae por debajo de un umbral crítico. Sin embargo, no existe ningún enfoque para revertir la disminución de la PKD1. Nuestras observaciones en riñones embrionarios normales nos llevaron a preguntarnos si Pkd1 está reprimido en cis en la PQRAD y si prevenir esta inhibición tiene un impacto modificador de la enfermedad. Primero examinamos el modelo ADPKD celular Pkd1RC / −. Se trata de una línea celular de ratón derivada del conducto colector que alberga la mutación RC sin sentido en un alelo Pkd1, mientras que el otro alelo está inactivado29. La mutación RC da como resultado la sustitución de arginina por cistina dos aminoácidos antes del segundo dominio transmembrana y reduce los niveles de proteína PC1 madura (funcional). La mutación RC se asigna al exón-30 de Pkd1 y está significativamente aguas arriba del motivo miR-17, que está codificado por el exón-46 de Pkd1. Esto nos permitió utilizar la edición CRISPR/Cas9 para eliminar el motivo 3′-UTR miR-17 del alelo RC (Pkd1RC∆17/−) (Figura complementaria 5). Generamos dos líneas celulares clonales Pkd1RC∆17/- independientes y las caracterizamos en relación con las células Pkd1RC/- y Pkd1RC/+ parentales no editadas. Anteriormente informamos que la expresión de PC1 se redujo en las células Pkd1RC/- en comparación con las células Pkd1RC/+. Sorprendentemente, el análisis de transferencia Western utilizando el anticuerpo 7E12 reveló que la eliminación del motivo miR-17 restauró la expresión de PC1 en las líneas celulares Pkd1RC∆17/- (Fig. 2a y Fig. Suplementaria 7a). A continuación, empleando varios ensayos independientes, demostramos que este grado de desrepresión de PC1 era suficiente para revertir varios eventos patogénicos bien conocidos relacionados con el crecimiento de quistes. Primero, notamos una mayor tasa de proliferación y un tamaño de quiste 3D en las células Pkd1RC/- que en las células Pkd1RC/+, que se normalizaron después de la desrepresión de PC1 en las células Pkd1RC∆17/- (Fig. 2b, c). En segundo lugar, observamos que mientras que el AMPc, la glucosa y la SAM aumentaron la proliferación ya elevada de las células Pkd1RC/-, las células Pkd1RC∆17/- eran resistentes a estos estímulos proproliferativos (Fig. 2d y Tabla complementaria 1). En tercer lugar, utilizamos MitoTracker para evaluar el potencial de la membrana mitocondrial como indicador de la fosforilación oxidativa y la inmunofluorescencia del anticuerpo anti-pCreb1 como lectura de la señalización de c-AMP. En comparación con las células Pkd1RC/+, observamos una señal MitoTracker reducida y una mayor expresión de pCreb1 en las células Pkd1RC/-. Lo contrario ocurrió con las células Pkd1RC∆17/-, que exhibieron una señal MitoTracker restaurada y una expresión reducida de pCreb1 (Fig. 2e y Fig. Suplementaria 6b). Finalmente, el análisis de inmunotransferencia reveló una expresión elevada de Yap1, pCreb1 y c-Myc en células Pkd1RC/- en comparación con las células Pkd1RC/+, que volvieron al valor inicial en células Pkd1RC∆17/- (Figura complementaria 6c).

una inmunotransferencia que muestra una expresión reducida de PC1 en células Pkd1RC/- en comparación con células Pkd1RC/+. El nivel de PC1 se restableció en las células Pkd1RCΔ17/-. #1 y #2 se refieren a las dos líneas celulares clonales Pkd1RCΔ17/- independientes. La actina sirve como control de carga. n = 3 muestras biológicamente independientes. b – c Imágenes representativas y cuantificación que muestran un aumento del tamaño del quiste 3D de Pkd1RC/- en comparación con las células Pkd1RC/+ cultivadas en Matrigel. El tamaño del quiste se normalizó en las células Pkd1RCΔ17/-. n = 300 quistes agrupados a partir de tres experimentos independientes. d Mapa de calor que muestra la proliferación evaluada con alamarBlue de células Pkd1RC/- y Pkd1RCΔ17/- en ausencia (-) o presencia (+) de AMPc 100 uM, glucosa 17 mM o SAM 100 uM. n = 8, cada círculo representa una réplica biológica. e Imágenes representativas que muestran el etiquetado Mito-tracker y la inmunotinción anti-pCreb1 en células Pkd1RC/+, Pkd1RC/- y Pkd1RCΔ17/-. n = 3 experimentos biológicamente dependientes. f Secciones de riñón macroscópicas y teñidas con H&E de ratones de 18 días con los genotipos indicados. Los datos de la descendencia de los tres fundadores se muestran por separado. Fundador n.º 1: Pkd1RC/+ (n = 7), Pkd1RC∆17/+ (n = 7), Pkd1RC/- (n = 8) y Pkd1RC∆17/- (n = 7). Fundador n.º 2: Pkd1RC/+ (n = 15), Pkd1RC∆17/+ (n = 19), Pkd1RC/- (n = 15) y Pkd1RC∆17/- (n = 17). Fundador n.º 3: Pkd1RC/+ (n = 6), Pkd1RC∆17/+ (n = 6), Pkd1RC/- (n = 8) y Pkd1RC∆17/- (n = 8). g Inmunoblot que muestra la expresión de PC1 en riñones de ratones de 18 días con los genotipos indicados derivados de los tres fundadores. La actina sirve como control de carga. n = 3 muestras de riñón independientes para cada genotipo y fundador. h, i Se muestran la relación KW/BW y los niveles de BUN en ratones con los genotipos indicados. Se muestran datos de los tres fundadores. Fundador n.° 1 (círculos azules), Fundador n.° 2 (círculos de color rosa claro) y Fundador n.° 3 (círculos naranjas). (j) Datos de secuencia de ARN de extremos emparejados que muestran el uso del alelo RC en Pkd1RC/- (círculos grises, n = 5), Pkd1RCΔ17/- fundador n.° 2 (círculos rosados, n = 5) y Pkd1RCΔ17/- fundador n.° 3 (círculos naranjas, n = 5). Las barras de error indican SEM. Análisis estadístico: ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey (c, h–j). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Con base en estos resultados alentadores, a continuación modelamos las eliminaciones de 3′-UTR ∆17 in vivo. Editamos KspCre+ con CRISPR; Pkd1RC/RC fertilizó huevos para eliminar el motivo miR-17 del alelo Pkd1 RC. Implantamos estos óvulos en ratones hembras sustitutas pseudopreñadas y finalmente obtuvimos tres KspCre+ heterocigotos transmisores de la línea germinal; Ratones fundadores Pkd1RC∆17/RC. Utilizando la PCR de ADN y la secuenciación de Sanger, validamos que el motivo miR-17 de hecho se eliminó en los tres ratones fundadores de un alelo RC, mientras que el otro alelo RC todavía contenía el 3′-UTR de tipo salvaje (Figura complementaria 8). Seleccionamos ratones con deleciones heterocigotas de ∆17 porque criarlos con ratones Pkd1F/F nos permitió generar los siguientes cuatro genotipos relevantes de la misma pareja reproductora: Pkd1RC/F (Pkd1RC/+), Pkd1RC∆17/F (Pkd1RC∆17/ +), KspCre+; Pkd1RC/F (Pkd1RC/-) y KspCre+; Pkd1RC∆17/F (Pkd1RC∆17/-). Los datos de la progenie de 18 días de los tres fundadores se muestran en las figuras 2F-H. Primero, observamos una histología y función renal normales en ratones Pkd1RC∆17 / +, lo que nuevamente indica que la eliminación del motivo miR-17 no altera Pkd1 ni produce PKD (Fig. 2f). Para cada progenie fundadora, observamos una expresión reducida de PC1, enfermedad renal quística grave, un aumento de la relación peso del riñón con respecto al peso corporal (KW/BW) y niveles séricos de BUN más altos en ratones Pkd1RC/- que en ratones Pkd1RC/+. (Figuras 2f-j). Al igual que con las líneas celulares, la eliminación del motivo miR-17 causó la desrepresión de PC1, según lo evaluado utilizando el anticuerpo 7E12, en los riñones Pkd1RC∆17/- en comparación con los riñones Pkd1RC/- (Fig. 2g). Verificamos la desrepresión de PC1 en líneas celulares y ratones utilizando un segundo anticuerpo independiente generado por el centro PKD de la Universidad de Maryland (ver métodos para más detalles) que detecta el extremo c de PC1 (Figura complementaria 7). Además, al utilizar RNA-seq de extremos pares, notamos un mayor uso del alelo RC en los riñones Pkd1RC∆17/- que en los riñones Pkd1RC/-, lo que indica además la desrepresión de Pkd1 (Fig. 2j). Sorprendentemente, la enfermedad quística se alivió casi por completo y el KW/BW y el BUN sérico casi se normalizaron en ratones Pkd1RC∆17/-en comparación con los ratones Pkd1RC/- (Fig. 2f-i). Para examinar los efectos a largo plazo, seguimos prospectivamente a la progenie de los fundadores n.° 2 y n.° 3 durante 8 y 18 semanas, respectivamente. La progenie del Fundador #2 exhibió un fenotipo de enfermedad quística agresiva, con el 76,4% (13/17) de los ratones Pkd1RC/- sucumbiendo a insuficiencia renal antes de las ocho semanas de edad (Figuras complementarias 9a, b). Además, los cuatro ratones Pkd1RC/- supervivientes presentaban PKD grave e insuficiencia renal casi mortal. Por el contrario, solo el 27,2% (6/22) de los ratones Pkd1RC∆17/- murieron a las ocho semanas, y los ratones supervivientes tenían menos quistes y una función renal relativamente conservada (Figura complementaria 9c-e). Toda la progenie del fundador#3 Pkd1RC/- sobrevivió hasta las 18 semanas de edad. Sin embargo, desarrollaron insuficiencia renal progresiva, como lo demuestra un nitrógeno ureico en sangre (BUN) promedio de >100 mg/dl y una creatinina sérica de >0,4 mg/dl (Fig. 3b). Los ratones Fundador #3 Pkd1RC∆17/- mostraron una progresión mínima de la enfermedad con BUN promedio <30 mg/dl y creatinina sérica <0,2 mg/dl (Fig. 3a, b).

a Imágenes macroscópicas de riñón y secciones de riñón teñidas con H&E de ratones de 18 semanas de edad con los genotipos indicados derivados del fundador n.° 3. La eliminación del motivo miR-17 se asoció con un beneficio sostenido y suprimió la progresión de la PKD a largo plazo. n = 3 (Pkd1RC/+), n = 3 (Pkd1RC∆17/+), n = 8 (Pkd1RC/-), y n = 7 (Pkd1RC∆17/-). b Se muestran los niveles de KW/BW, BUN y creatinina sérica (Scr) en la progenie de 18 semanas del fundador n.° 3. c Mapa de calor que muestra perfiles globales de expresión de ARNm de riñones de ratones de 18 días con los genotipos indicados. Se eligieron para la visualización los ARNm que estaban desregulados en los riñones Pkd1RC/- en comparación con los riñones Pkd1RC/+ pero que mostraban una expresión mejorada en los riñones Pkd1RCΔ17/-. #3 = fundador#3; #2 = fundador#2. n = 3 (Pkd1RC/+), n = 3 (Pkd1RC∆17/+ fundador 2), n = 3 (Pkd1RC∆17/+ fundador 3), n = 5 (Pkd1RC/-), n = 5 (Pkd1RC∆ 17/- fundador 2), y n = 5 (Pkd1RC∆17/- fundador 3). ( d ) Imágenes representativas que muestran inmunotinción con fosfohistona-H3 (pHH3), receptor de manosa tipo C 1 (MRC1) o pCreb1 en secciones de riñón de Pkd1RC/- de 18 días y 18 semanas (n = 5 ) y ratones Pkd1RCΔ17/- (n = 5). Las secciones se etiquetaron conjuntamente con DBA para marcar los quistes derivados del conducto colector. Las barras de error indican SEM. Análisis estadístico: ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey (b). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La desregulación transcriptómica a gran escala, la activación de la proliferación tubular y la señalización oncogénica y la inflamación intersticial son algunas de las características patológicas clave de la PQRAD. A continuación, abordamos si estos cambios fueron mitigados por la desrepresión de PC1. Realizamos análisis de secuencia de ARN utilizando muestras de riñón de ratones Pkd1RC/+, Pkd1RC∆17/+, Pkd1RC/- y Pkd1RC∆17/- de 18 días. Observamos una desregulación de una extensa red de transcripciones de genes con una regulación positiva de 4157 y una regulación negativa de 2067 ARNm en Pkd1RC/- quístico en comparación con los riñones de control Pkd1RC/+ no quísticos (Fig. 3c). Reflejando la histología del riñón, Pkd1RC∆17/+ exhibió un patrón de expresión génica casi idéntico al del riñón Pkd1RC/+. Sorprendentemente,> 95% de los ARNm desregulados en los riñones Pkd1RC/- mostraron una expresión mejorada (o normalizada) en los riñones Pkd1RC∆17/- (Fig. 3c). De acuerdo con los datos de RNA-seq, el análisis de inmunotransferencia reveló c-Myc y Yap1 reducidos en los riñones de ratones Pkd1RC∆17/- de 18 días de edad en comparación con ratones Pkd1RC/- (Figura complementaria 9f). Finalmente, el análisis de inmunofluorescencia demostró menos células anti-fosfo-Histona-H3 positivas, lo que indica una menor proliferación, y señales reducidas anti-pCreb1 y anti-MRC1, lo que implica una señalización atenuada de c-AMP e inflamación asociada a quistes, respectivamente, en riñones de 18 Ratones Pkd1RC∆17/- de -días y 18 semanas de edad en comparación con ratones Pkd1RC/- (Fig. 3d).

Una pregunta de larga data ha sido si el aumento de PC2 puede compensar un PC1 bajo. Curiosamente, al igual que PKD1, PKD2 alberga un motivo 3′-UTR miR-17 conservado evolutivamente. Nuestro trabajo indica una mayor actividad represiva de miR-17 en modelos de PQRAD con mutación Pkd1. Por lo tanto, nos preguntamos si Pkd2 está inhibido en cis y si la prevención de esta autoinhibición tiene un impacto positivo en la progresión de la enfermedad en modelos mutantes de Pkd1. Para abordar estas preguntas, comenzamos nuevamente con el modelo celular Pkd1RC/-, pero esta vez usamos CRISPR/Cas9 para eliminar los motivos miR-17 del Pkd2 3′-UTR (Pkd1RC/-; Pkd2∆17/∆17) mientras manteniendo intacto el motivo Pkd1 miR-17 (Figura complementaria 10). De acuerdo con la inhibición cis de 3′-UTR, utilizando qRT-PCR y análisis de inmunotransferencia, observamos una mayor expresión de Pkd2 y PC2 en dos Pkd1RC/-; Líneas celulares clonales Pkd2∆17/∆17 en comparación con sus células Pkd1RC/- parentales no editadas (Fig. 4a). La expresión de PC1 permaneció sin cambios entre las células editadas y no editadas, lo que indica la especificidad de la eliminación del motivo miR-17 de Pkd2 3′-UTR (Figura complementaria 11b). Sorprendentemente, observamos que la desrepresión de PC2 se asoció con un crecimiento reducido de quistes 3D, una señal restaurada de MitoTracker y una regulación negativa de la expresión de pCreb1, Yap1, Mettl3 y c-Myc en Pkd1RC/-; Células Pkd2∆17/∆17 en comparación con células Pkd1RC/- (Fig. 4b-d y Fig. complementaria 11b-c). Como fue el caso con las deleciones 3′-UTR de Pkd1, mientras que AMPc, glucosa y SAM promovieron la proliferación de células Pkd1RC/-, observamos que este efecto estimulador se perdió en Pkd1RC/-; Células Pkd2∆17 / ∆17 (Fig. 4e, Tabla complementaria 2).

una inmunotransferencia que muestra la expresión de policistina-2 (PC2) en células con los genotipos indicados. La eliminación del motivo miR-17 de Pkd2 3′-UTR conduce a una mayor expresión de PC2 en las células Pkd1RC/-. La actina sirve como control de carga. #1 y #2 se refieren a los dos Pkd1RC/- independientes; Líneas celulares clonales Pkd2Δ17/Δ17. n = 3 muestras biológicamente independientes para ambos clones. b, c Imágenes representativas y cuantificación que muestran el tamaño del quiste en 3D de las células con los genotipos indicados cultivados en cultivos de Matrigel. n = 300 quistes agrupados a partir de tres experimentos independientes. d Imágenes representativas que muestran el etiquetado con mitotracker y la inmunotinción anti-pCreb1 en células con los genotipos indicados. n = 3 experimentos biológicamente independientes. e Mapa de calor que muestra la proliferación de Pkd1RC/- y Pkd1RC/- evaluada con alamarBlue; Células Pkd2Δ17/Δ17 en ausencia (-) o presencia (+) de AMPc, glucosa o SAM. n = 8, cada círculo representa una réplica biológica. f Se muestran secciones de riñón teñidas con H&E de ratones de 18 días con los genotipos indicados. n = 3 (Pkd1RC/+; Pkd2+/+), n = 3 (Pkd1RC/+; Pkd2∆17/∆17), n = 8 Pkd1RC/-; Pkd2+/+), y n = 11 (Pkd1RC/-; Pkd2∆17/∆17). g Inmunotransferencias que muestran la expresión de PC2, Yap1 y c-Myc en riñones de ratones de 18 días con los genotipos indicados (n = 3 para cada grupo). h, i KW/BW y niveles de creatinina sérica en ratones de 18 días con los genotipos indicados. j Imágenes representativas que muestran la inmunotinción de pHH3 y MRC1 en secciones de riñón de ratones de 18 días con los genotipos indicados (n = 3 para cada grupo). k Mapa de calor que muestra la expresión diferencial de ARNm en riñones de ratones de 18 días con los genotipos indicados (n = 3). ARNm que estaban desregulados en Pkd1RC/- en comparación con los riñones Pkd1RC/+ pero exhibieron una expresión mejorada en Pkd1RC/-; Se eligieron los riñones Pkd2Δ17/Δ17 para la visualización del mapa de calor. Las barras de error indican SEM. Análisis estadístico: ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey (b, h, i). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Nuestras observaciones en células Pkd1RC/- sugieren una tentadora posibilidad de que prevenir la inhibición cis de Pkd2 y mejorar la expresión de PC2 compense y retrase la progresión de la enfermedad en modelos mutantes de Pkd1. Probamos esta noción in vivo eliminando el motivo Pkd2 3′-UTR miR-17 (Pkd2∆17/∆17) en ratones Pkd1RC/-. Brevemente, editamos KspCre con CRISPR/Cas9; ratones Pkd1RC/RC para generar KspCre; Pkd1RC/RC; Ratones Pkd2∆17/+ (consulte la Fig. 12 complementaria para más detalles). Luego, estos ratones se cruzaron con ratones Pkd1F/F para generar finalmente los siguientes cuatro genotipos: (i) Pkd1RC/F; Pkd2+/+, (ii) Pkd1RC/F; Pkd2∆17/∆17, (iii) KspCre; Pkd1RC/F; Pkd2+/+ y (iv) KspCre; Pkd1RC/F; Pkd2∆17/∆17. La caracterización de estos ratones reveló que la eliminación del motivo Pkd2 miR-17 en el entorno no quístico no causó una regulación positiva de PC2, y tanto Pkd1RC/F; Pkd2+/+ y Pkd1RC/F; Los ratones Pkd2∆17 / ∆17 exhibieron histología y función renal normales (Fig. 4f, g). Por el contrario, la eliminación del motivo Pkd2 miR-17 en ratones quísticos Pkd1RC/- se asoció con una mayor expresión de PC2. Además, los niveles de KW/BW y creatinina sérica se redujeron en un 34,8 y un 25%, respectivamente, en Pkd1RC/-; Pkd2∆17/∆17 en comparación con Pkd1RC/-; Ratones Pkd2 +/+ (Fig. 4h, i). Consistentemente, observamos que en comparación con Pkd1RC/-; riñones Pkd2+/+, Pkd1RC/-; Los riñones Pkd2∆17 / ∆17 exhibieron una expresión reducida de c-Myc y Yap1 (Fig. 4G) y una menor proliferación de quistes e inflamación intersticial (Fig. 4j). Como caracterización fenotípica adicional, realizamos un análisis de secuencia de ARN para comparar el perfil transcriptómico del riñón en los cuatro grupos de ratones (Fig. 4k). Los patrones de expresión de ARNm fueron casi idénticos en Pkd1RC/F; Pkd2+/+ y Pkd1RC/F; Pkd2∆17/∆17, lo que implica además que la eliminación del motivo Pkd2 miR-17 tiene un impacto mínimo en los riñones no quísticos. Como era de esperar, el quístico Pkd1RC/-; Los riñones Pkd2+/+ exhibieron una desregulación generalizada del ARNm en comparación con Pkd1RC/+ no quístico; Pkd2+/+ controla los riñones. Descubrimos que la eliminación del motivo Pkd2 miR-17 se asoció con una expresión mejorada de casi el 50% de estos ARNm desregulados en Pkd1RC/-; Pkd2∆17/∆17 (Fig. 4k).

Nuestros modelos de PQRAD clonal celular o de ratón editados con CRISPR conducen a una desrepresión crónica de Pkd1 o Pkd2. Por lo tanto, no pudimos evaluar si la desrepresión aguda de Pkd1/2, justo cuando se están formando los quistes, prevendrá la aparición de la enfermedad o si la restauración de Pkd1/2 puede reinar en la PKD establecida. Para responder a estas preguntas, empleamos el oligonucleótido anti-miR-17 RGLS4326 como una herramienta para bloquear de forma aguda la inhibición cis de Pkd1 y Pkd2. Primero, confirmamos que, en comparación con el vehículo (PBS) o el oligonucleótido de control, RGLS4326 aumentó la expresión de Pkd1/2 y PC1/2 en células Pkd1RC/- (Fig. 5a, b). El efecto potenciador de Pkd1/2 de RGLS4326 fue evidente tres días después del tratamiento. Es importante destacar que el tratamiento con RGLS4326 no produjo niveles más altos de PC1 y PC2 en Pkd1RC∆17/- y Pkd1RC/-; Líneas celulares Pkd2∆17/∆17, respectivamente, lo que confirma que la regulación positiva de las policistinas por este oligonucleótido se basa en el motivo miR-17 en Pkd1/2 3′-UTR (Figura complementaria 14b-c). Las células Pkd1RC/- tratadas con RGLS4326 tuvieron una proliferación reducida, produjeron quistes más pequeños en cultivos de Matrigel 3D, exhibieron una menor expresión de Yap1, c-Myc y pCreb1, y una señal MitoTracker más alta en comparación con las células Pkd1RC/- tratadas con PBS o con oligonucleótidos de control ( Figura complementaria 13). El efecto reductor de quistes de RGLS4326 estuvo presente pero atenuado en Pkd1RC∆17/- o Pkd1RC/-; Líneas celulares Pkd2∆17/∆17, lo que sugiere que este compuesto media sus beneficios en las células Pkd1RC/- principalmente a través de la desrepresión de Pkd1/2 (Figura complementaria 14d-g). A continuación, probamos el impacto del aumento agudo de Pkd1/2 en células Pkd1RC/- después de que ya se habían formado quistes. Cultivamos células Pkd1RC/- no tratadas en Matrigel durante cuatro días, permitiendo que el quiste creciera. Luego tratamos estos quistes con un vehículo, oligonucleótido de control o RGLS4326, y los monitoreamos durante tres días adicionales. Los quistes tratados con oligonucleótidos con vehículo y control casi triplicaron su tamaño, mientras que el tratamiento con RGLS4326 suprimió este crecimiento (Fig. 5c).

a – b qRT-PCR y análisis de inmunotransferencia que muestran la expresión de Pkd1/PC1 y Pkd2/PC2 en células Pkd1RC/- transfectadas con vehículo (PBS), oligonucleótido de control 100 uM o RGLS4326 100 uM. c Imágenes y cuantificación del tamaño del quiste 3D de células Pkd1RC/- cultivadas en Matrigel antes (día 4) o después (día 7) de la transfección con vehículo (PBS), oligonucleótido de control 100 uM o RGLS4326 100 uM. d Secciones de riñón teñidas con H&E de ratones Pkd1RC/- de 18 días de edad inyectados en P10, P11, P12 y P16 con vehículo (PBS), 20 mg/kg de oligonucleótido de control o 20 mg/kg de RGLS4326. Como referencia, se muestra una sección de riñón teñida con H&E de un ratón de tipo salvaje de 18 días de edad no tratado. Se muestran, por ejemplo, KW/BW, BUN y creatinina sérica en ratones Pkd1RC/- de 18 días de edad tratados con vehículo (PBS), 20 mg/kg de oligonucleótido de control o 20 mg/kg de RGLS4326. Se muestran como referencia los datos de ratones de tipo salvaje de 18 días de edad no tratados. h Secciones de riñón teñidas con H&E de ratones Pkd1RC/- de 26 días de edad inyectados en P16 y P17 con 20 mg/kg de oligonucleótido de control o 20 mg/kg de RGLS4326. Se ha demostrado que las secciones de riñón teñidas con H&E de ratones Pkd1RC/- de 16 días de edad genéticamente compatibles pero no tratados representan la enfermedad antes de comenzar el tratamiento. Se muestran los niveles i – k KW/BW, BUN y creatinina sérica en ratones Pkd1RC/- de 16 días de edad no tratados o de 26 días de edad tratados. Se inyectaron ratones l – n Pkd1RC / - en P16 y P17 con vehículo, 20 mg / kg de RGLS4326 o 20 mg / kg de oligonucleótido de control. Luego, estos ratones recibieron su respectivo régimen de tratamiento cada semana hasta las 18 semanas de edad. La cuarta cohorte de ratones Pkd1RC/- recibió 20 mg/kg de tratamiento con RGLS4326 en P16, P17 y posteriormente cada dos meses. l Se muestran secciones de riñón teñidas con H&E de ratones Pkd1RC/- de 125 días de edad en el vehículo o en el tratamiento con RGLS4326. m Curvas de supervivencia de Kaplan-Meir de ratones Pkd1RC/- en los cuatro grupos de tratamiento. La supervivencia del tipo salvaje no tratado se muestra como referencia. n Relación KW/BW en ratones que sobrevivieron hasta 125 días. Ratones de tipo salvaje: n = 3; Ratones Pkd1RC/-: n = 2 (tratamiento con vehículo), n = 5 (tratamiento semanal con RGLS4326) y n = 7 (tratamiento bimensual con RGLS4326). Las barras de error indican SEM. Análisis estadístico: ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey (a, c, e–g, i–k, n); Mantel-Cox (m). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, examinamos si las observaciones en células pueden replicarse in vivo. En el primer estudio, tratamos ratones Pkd1RC/- con vehículo (PBS), oligonucleótido de control o RGLS4326 a partir de P10, la edad en la que los quistes comienzan a formarse en este modelo. En P18, notamos un marcado agrandamiento del riñón con una relación KW / BW> 10 veces mayor y BUN elevado y creatinina sérica en PBS y ratones tratados con oligonucleótidos de control en comparación con ratones de tipo salvaje de la misma edad (Fig. 5d-g). Sorprendentemente, la PKD prácticamente se previno y la función renal se mantuvo normal en ratones Pkd1RC / - tratados con P18 RGLS4326 (Fig. 5d-g). En el segundo estudio, comenzamos el tratamiento en P16 cuando los ratones Pkd1RC/- ya habían desarrollado la enfermedad quística. En P26, uno de los 15 ratones tratados con oligonucleótidos de control había muerto y los ratones supervivientes habían desarrollado un agrandamiento progresivo de los riñones y una insuficiencia renal casi mortal. Por el contrario, observamos una atenuación de la progresión de la PKD y la estabilización de la función renal en ratones Pkd1RC / -KO tratados con RGLS4326 (Fig. 5h-k). Finalmente, en un tercer estudio, evaluamos los efectos a largo plazo de la desrepresión de Pkd1/2 en ratones que ya habían desarrollado PKD. Tratamos ratones Pkd1RC/- en P16 y P17 con el vehículo, 20 mg/kg de RGLS4326 o 20 mg/kg de oligonucleótido de control. Luego, estos ratones recibieron sus respectivos regímenes de tratamiento cada semana hasta las 18 semanas de edad. Un cuarto grupo de ratones Pkd1RC/- recibió 20 mg/kg de tratamiento con RGLS4326 en P16 y P17 y posteriormente cada dos semanas. El 85,7% (12 de 14) de los ratones Pkd1RC/--KO tratados con PBS y el 100% (14 de 14) de los tratados con oligonucleótidos de control sucumbieron a su enfermedad antes de las 18 semanas de edad. Por el contrario, el 70% (7 de 10) y el 50% (5 de 10) de los ratones Pkd1RC/- tratados con RGLS4326 bimensual o semanalmente, respectivamente, sobrevivieron hasta las 18 semanas de edad (Fig. 5m). Además, notamos un parénquima renal sustancialmente conservado (Fig. 5l y Fig. 15 complementaria) y una reducción de KW/BW (Fig. 5n) entre los ratones supervivientes en el grupo RGLS4326. Por lo tanto, la desrepresión farmacéutica aguda de Pkd1/2, incluso después de la aparición del quiste, atenúa la PKD murina.

Una pregunta lógica pero crucial es si la inhibición cis de PKD1/2 es una característica de la PQRAD humana. Obtuvimos estas células de quistes de muestras de nefrectomía por ADPKD recién descartadas de cuatro individuos afectados (tres hombres de 41, 48 y 52 años y una mujer de 57 años). Realizamos análisis de mutaciones de PKD1 y PKD2 utilizando ADN de células de quiste (Figura complementaria 16). Las líneas celulares #1, #3 y #4 albergan mutaciones heterocigotas de PKD1, mientras que la línea celular #2 alberga una mutación heterocigota de PKD2 truncada y una mutación heterocigota de PKD1 sin sentido. Para evaluar el potencial de traducción de nuestros hallazgos en ratones, utilizamos la edición CRISPR/Cas9 para eliminar el motivo miR-17 PKD1 o PKD2 en estos cultivos primarios de PQRAD (Figura 17 complementaria). Diseñamos sgRNA específicos para humanos dirigidos a los motivos miR-17 en las 3′-UTR de PKD1 o PKD2. Luego, transfectamos cultivos primarios de ADPKD de los cuatro donantes con Cas9 y sgRNA de PKD1 o PKD2 3′-UTR. Las células transfectadas simuladamente de cada donante sirvieron como controles parentales sin editar. Notamos niveles más altos de PC1 dentro de los tres días posteriores al modelado del alelo PKD1∆17 en los cuatro cultivos transfectados con CRISPR en comparación con sus respectivos controles parentales transfectados simuladamente (Fig. 6a). De manera similar, el modelado de los alelos PKD2∆17 condujo a una mayor expresión de PC2 en cultivos transfectados con CRISPR que sus respectivos controles parentales transfectados de forma simulada (Fig. 6b). A continuación, evaluamos la importancia funcional de la desrepresión de PKD1 o PKD2 mediante la realización de cistogénesis Matrigel 3D, ensayos de proliferación de alamarBlue, etiquetado MitoTracker de células vivas e inmunofluorescencia anti-pCREB1. Los cultivos transfectados con CRISPR que contenían células PKD1∆17 o PKD2∆17 formaron quistes más pequeños (Fig. 6c-f) y mostraron tasas de proliferación más bajas (Fig. 18 complementaria), mayor señal de MitoTracker y menor expresión de pCREB1 en comparación con sus respectivos cultivos simulados. controles transfectados y sin editar (Fig. 6g, h). Estos datos implican una inhibición cis continua de PKD1/2 y demuestran el beneficio potencial de desreprimir PKD1/2 en células ADPKD humanas.

Se utilizó la edición CRISPR/Cas9 para eliminar el motivo miR-17 de PKD1 3′-UTR (PKD1Δ17) o PKD2 3′-UTR (PKD2Δ17) en cultivos primarios de ADPKD de cuatro donantes humanos (#1 a #4). a, b Inmunotransferencias que muestran una mayor expresión de PC1 en PKD1Δ17 y una mayor expresión de PC2 en cultivos de ADPKD de PKD2Δ17 en comparación con sus respectivos cultivos de ADPKD parentales sin editar (UE). Las bandas de proteínas tienen un tamaño de 460 kDa (a) y de 110 a 120 kDa (b). La actina sirve como control de carga. c – f Imágenes y cuantificación que muestran un tamaño reducido de quiste de PKD1Δ17 y PKD2Δ17 en comparación con sus respectivos cultivos parentales de PQRAD sin editar (UE). g, h Imágenes que muestran un etiquetado de mitotracker más alto (rojo) y una inmunotinción de pCREB1 reducida (verde) en cultivos de PKD1Δ17 y PKD2Δ17 ADPKD en comparación con sus respectivos cultivos de ADPKD parentales sin editar. n = 3 experimentos biológicamente independientes para cada línea celular. Las barras de errores representan SEM, análisis estadístico: prueba t de Student de dos colas (e, f). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La pérdida de función de PKD1 heterocigótica como causa genética de la PKD1 se descubrió hace más de 25 años31,32,33, pero los enfoques para restaurar la expresión de PKD1 siguen siendo difíciles de alcanzar. En este trabajo, proporcionamos un marco factible para aumentar los niveles endógenos de PKD1 y mostramos por primera vez que la desrepresión monoalélica de Pkd1 es suficiente para aliviar la PKD preclínica.

Una explicación unificadora y parsimoniosa para la aparición de la PQRAD es que la cistogénesis se produce cuando la dosis funcional de PKD1 cae entre un 70% y un 80%, por debajo de un umbral crítico3. Por lo tanto, la inactivación de la línea germinal de un alelo PKD1 por sí sola no puede explicar esta magnitud de reducción de dosis. Se requieren eventos estocásticos adicionales que reprimen el alelo restante y desempeñan un papel fundamental en la determinación del inicio de la enfermedad. En este sentido, descubrimos que la traducción ineficiente mediada por miR-17 de los ARNm transcritos por el alelo PKD1 no inactivado representa un mecanismo de aparición de ADPKD inhibidor somático y dirigible. Como característica de seguridad atractiva, la inhibición de Pkd1 por miR-17 parece ser un fenómeno específico de la PQRAD, ya que observamos que el nivel de miR-17 es bajo en los riñones de ratones adultos normales y, por lo tanto, no tiene ningún impacto en la estabilidad del ARNm de Pkd1 en el entorno no quístico. Por el contrario, la familia de miARN miR-17 se activa en modelos de PKD, donde parece mediar la represión de Pkd1 hasta bien entrada la edad adulta, como lo demuestra la atenuación del crecimiento del quiste por el fármaco anti-miR-17 RGLS4326, incluso si se inicia el tratamiento. en etapas posteriores de la enfermedad. Una advertencia digna de mención aquí es que, si bien RGLS4326 aumenta los niveles de PC1, sus beneficios en etapas posteriores de la enfermedad podrían derivarse de la desrepresión simultánea de otros objetivos de miR-17, incluidos PC2 y Ppara. Otra idea de nuestro trabajo es que la restauración potencial de mutantes hipomórficos de Pkd1 puede ser un enfoque terapéutico beneficioso. Como nota de precaución, particularmente para las modalidades que emplean suplementación exógena de PKD1, elevar Pkd1 por encima de los niveles de tipo salvaje produce enfermedad quística en ratones34,35. Sin embargo, la singularidad de nuestro método es que, en lugar de la transactivación, se basa en la prevención de la inhibición, lo que hace poco probable que PKD1 alcance el rango supraterapéutico. Como señal de que la inhibición de PKD1 mediada por miR-17 puede incluso ser relevante en individuos con ADPKD, observamos que la eliminación del motivo PKD1 miR-17 en cultivos primarios de ADPKD humana aumenta la PC1 y reduce el crecimiento y la proliferación de quistes 3D. De manera similar, la inhibición de miR-17 aumenta los niveles de PC1 e inhibe el crecimiento de quistes y la proliferación de cultivos primarios de PQRAD humana4,30. Como prueba adicional, un reciente ensayo clínico de fase 1b demostró que el tratamiento con RGLS4326 se asocia con niveles más altos de PC1 en orina en pacientes con PQRAD36. Se planean estudios clínicos adicionales utilizando el oligo anti-miR-17 RGLS8429 de próxima generación.

Nuestros estudios también aclaran el papel de PKD1 en la expansión y el crecimiento continuo de los quistes renales. Junto con la iniciación del quiste, la inhibición de PKD1 desencadena una desregulación metabólica y transcriptómica a gran escala y activa numerosas vías oncogénicas, como cAMP y c-Myc/Yap4,37,38,39,40,41,42,43,44,45. A su vez, se cree que esta señalización patógena de quistes aguas abajo impulsa la expansión del quiste. A pesar de una desregulación tan generalizada, un elegante estudio reciente informó que la reconstitución transgénica de Pkd1 o Pkd2 revierte rápidamente la enfermedad quística establecida en ratones46. Consistentemente, encontramos que la desrepresión aguda de Pkd1/2 reina en la enfermedad quística establecida y hace que las células mutantes de Pkd1 sean resistentes a los estímulos procistogénicos como el AMPc y el SAM. Estas observaciones apuntan colectivamente a la PKD1 como el factor principal, si no el único, que rige la aparición y el crecimiento de los quistes.

Informamos un hallazgo inesperado de que Pkd2 influye en el fenotipo quístico de los modelos mutantes de Pkd1. PC1 y PC2 interactúan físicamente y se coexpresan en múltiples ubicaciones subcelulares, lo que indica que las dos proteínas funcionan en la misma vía fisiológica47,48,49,50. Agregamos una nueva dimensión al extender esta relación al contexto patológico. Quizás, mejorar la expresión de Pkd2 en células mutantes de Pkd1 pueda mejorar el tráfico de PC1 y/o formar complejos de proteínas PC1-PC2 más heteroméricos.

Finalmente, nuestro trabajo proporciona nuevos conocimientos sobre la biología de los miARN. Es bien sabido que los miARN reprimen de forma simultánea pero sutil grandes redes de ARNm. Nuestro enfoque desacopla y desenreda esta pleiotropía en el contexto de la PKD. Ideamos un sistema en el que se evita que miR-17 se una a Pkd1 (o Pkd2) mientras su capacidad para interactuar con sus otros objetivos de ARNm permanece intacta. Sorprendentemente, la eliminación de solo un motivo 3′-UTR miR-17 fenocopia los efectos de inhibir todos los miR-17 en los modelos Pkd1RC/-. Por lo tanto, nuestro trabajo es uno de los primeros en demostrar que, en algunas circunstancias, la mayor parte del efecto biológico de un miARN puede derivarse de la represión de un puñado de sus objetivos. Existen algunos paralelismos entre nuestro trabajo y el eje miR-122 - infección por hepatitis C (VHC) en términos de atacar el ARN central de la enfermedad. Sin embargo, el mecanismo miR-122 no es convencional porque se dirige al genoma extraño del ARN del VHC, se une a la 5′-UTR y ayuda en la acumulación del VHC51,52.

La mayoría de los miARN son prescindibles para las funciones homeostáticas de los tejidos y se inhiben farmacéuticamente con relativa facilidad. A pesar de estas características favorables, el desarrollo de fármacos basados en miARN ha languidecido en comparación con otras formas de terapias con ARN53. Esto se debe en parte a que el mecanismo molecular pleiotrópico de numerosos objetivos de ARNm posteriores dificulta la validación del efecto biológico del miARN o el desarrollo de lecturas farmacodinámicas de fármacos anti-miARN. Sostenemos que priorizar los miARN que funcionan como inhibidores tónicos de un puñado de ARNm centrales de enfermedades probablemente sea una estrategia fructífera para el desarrollo de fármacos. Es importante destacar que nuestros conocimientos son transferibles y especulamos que existen modos similares de regulación cis-inhibitoria terapéuticamente abordables en otros trastornos, especialmente en condiciones monogenéticas haploinsuficientes.

Eliminamos el sitio de unión de miR-17 de Pkd1 o Pkd2 3′-UTR usando CRISPR / Cas9. Diseñamos sgRNA utilizando www.benchling.com y ordenamos las secuencias a IDT. El par de sgRNA se dirigió a secuencias de ADN aguas arriba y aguas abajo del motivo miR-17 en los genes Pkd1 o Pkd2. Clonamos los sgRNA en el vector de expresión de mamíferos CRISPR pSpCas9 (BB) −2A-GFP54. Utilizando estos plásmidos que codifican sgRNA, generamos la línea celular Pkd1RC∆17/- y Pkd1RC/-; Línea celular Pkd2∆17/∆17 como se describe a continuación. Para generar la línea celular Pkd1RC∆17/-, transfectamos células Pkd1RC/- con 0,6 µg del plásmido SpCas9-2A-GFP que transporta el sgRNA aguas arriba o aguas abajo usando Lipofectamine 3000. Después de 72 h, realizamos FACS para seleccionar GFP- células positivas con el 5% de intensidad superior. Estas células experimentaron expansión clonal en placas de 96 pocillos. Se analizaron colonias bien formadas para detectar la ausencia del sitio de unión de miR-17 mediante PCR de ADN de la secuencia genómica de Pkd1 objetivo. Los clones con bandas de deleción esperadas fueron confirmados mediante secuenciación de Sanger. Se caracterizaron y analizaron más a fondo dos líneas celulares clonales Pkd1RC∆17/- con deleciones confirmadas junto con sus líneas celulares de control parental, como se muestra en la Fig. 2 y en la Fig. 4 complementaria. Utilizamos la misma estrategia y enfoque experimental para generar los dos Pkd1RC. /-; Líneas celulares Pkd2∆17/∆17 (Fig. 4 y Fig. complementaria 8). Las secuencias de sgRNA y los cebadores de genotipado se proporcionan en la Tabla complementaria 3.

Se utilizaron las siguientes cepas de ratones: (1) para los modelos de ratón mostrados en la Fig. 1, se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6 N de tipo salvaje; (2) para los modelos de ratón mostrados en las Figs. 2 y 4 utilizamos KspCre; Ratones Pkd1RC/RC mantenidos en un fondo C57BL/6 J por nuestro laboratorio. Ratones hembra prepúberes se sometieron a superovulación utilizando un régimen hormonal estándar. El epidídimo se recogió de ratones macho para la recolección de esperma. Después de la fertilización in vitro, se aislaron óvulos fertilizados unicelulares. Los reactivos CRISPR (IDT) se administraron al citoplasma mediante electroporación utilizando un superelectroporador Nepa21 (NEPAGENE, Ichikawa, Japón). Los huevos que sobrevivieron a la electroporación se lavaron y cultivaron en medio M16 fresco en cultivos de microgotas. Luego, los huevos se transfirieron quirúrgicamente a los oviductos de hembras ICR pseudopreñadas del día 1. A los 21 días de edad, se examinó a los ratones fundadores para detectar la eliminación del sitio de unión de miR-17 mediante genotipado, y la confirmación de la eliminación se realizó mediante secuenciación de Sanger.

En este estudio se utilizaron ratones KspCre, Pkd1F/F y Pkd1RC/RC4,24,30,55. Todos los ratones se mantuvieron en un fondo C57BL/6 J. En momentos de tiempo preespecificados, los ratones se anestesiaron utilizando un protocolo aprobado y se obtuvo sangre mediante punción cardíaca. Se pesó el riñón derecho para obtener la relación KW/BW y se congeló inmediatamente para futuros análisis moleculares. El riñón izquierdo se perfundió con PBS 1X helado y paraformaldehído al 4% (peso/vol). Posteriormente, el riñón fue incluido en parafina. Todos los estudios utilizaron números iguales de hombres y mujeres. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UT Southwestern aprobó todos los experimentos con animales.

Pkd1RC/+ y Pkd1RC/- son líneas celulares epiteliales isogénicas derivadas del conducto colector. Estas células se generaron a partir de los riñones de un ratón macho Pkd1RC/flox de 14 días. Se creó una suspensión unicelular triturando el tejido renal en cubos de 1 mm seguido de una incubación durante 40 minutos en DMEM que contenía colagenasa al 5% (Sigma #C1639, EE. UU.) a 37 °C con agitación intermitente. Luego, las células se incubaron con aglutinina biotinilada de Dolichos Biflorus (DBA, un marcador del conducto colector) (Vector labs #B-1035) durante 1 h. Las células positivas para DBA se aislaron utilizando un kit de aglutinante CELLection Biotin (Invitrogen n.º 11533D). Posteriormente, las células se inmortalizaron utilizando el kit de inmortalización de células del antígeno T SV40 (Alstem #CILV01). Un clon Pkd1RC/Flox inmortalizado y positivo para SV40 se infectó con un adenovirus que expresa la recombinasa Cre (Vector Biolabs #1779) para eliminar el alelo floxed, generando así las células Pkd1RC/-. La recombinación del alelo floxed se confirmó mediante genotipado. El clon parental no infectado con el genotipo Pkd1RC/+ (donde '+' es el alelo floxed) sirve como control. Estas células se mantienen en un medio de cultivo epitelial (medio de Eagle modificado por Dulbecco/medio F-12 de Ham suplementado con suero bovino fetal al 2%, insulina (8,3 × 10-7 m), prostaglandina E1 (7,1 × 10-8 m), selenio (6,8 × 10-9 m), transferrina (6,2 × 10-8 m), triyodotironina (2 × 10-9 m), dexametasona (5,09 × 10-8 m) e interferón γ recombinante (10 unidades/ml) a 37°C.

Las células Pkd1+/+ y Pkd1-/- son líneas celulares epiteliales isogénicas derivadas de túbulos renales. Estas células se generaron a partir de los riñones de una cría de ratón macho Pkd1F/F de 12 días de edad. Se aislaron los riñones y se trituraron en cubos de 1 mm. El tejido se incubó durante 40 minutos en DMEM que contenía colagenasa al 5% (Sigma #C1639, EE. UU.) a 37 °C con agitación intermitente para crear una suspensión unicelular. Luego, las células se filtraron usando un colador celular de 40 micrones y se incubaron con aglutinina biotinilada de Dolichos Biflorus (DBA) (Vector labs #B-1035) durante 1 h. Las células positivas para DBA se aislaron utilizando un kit de aglutinante CELLection Biotin (Invitrogen n.º 11533D). Posteriormente, las células se inmortalizaron utilizando el kit de inmortalización de células del antígeno T SV40 (Alstem #CILV01) y se cultivaron mediante expansión clonal. Se examinaron los clones para detectar el marcador SV40 mediante genotipado de SV40 y se seleccionó un clon para cultivo adicional. Las células Pkd1-/- se generaron infectando las células Pkd1F/F con un adenovirus que expresa la recombinasa Cre (Vector Biolabs #1779) de modo que los alelos floxados sean eliminados. Las células infectadas se cultivaron mediante expansión clonal. Los clones se genotiparon para confirmar la recombinación exitosa y la eliminación de ambos alelos Pkd1. Las células originales Pkd1F/F y Pkd1-/- se caracterizaron adicionalmente mediante qRT-PCR y análisis de transferencia Western (Figura complementaria 2). Estas células se cultivan y mantienen en un medio de cultivo de células epiteliales como se describe en la sección anterior.

La inclusión del tejido en parafina y el posterior corte se realizaron utilizando protocolos estándar por parte del núcleo de Histología del UT Southwestern Medical Center. Los tejidos se cortaron en secciones de 5 µm y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E) para análisis histológico. Se tomaron imágenes de las secciones teñidas utilizando un escáner de diapositivas.

Se utilizó un kit Qiagen miRNEASY para la extracción de ARN total. El ADNc se preparó utilizando un kit de síntesis de ADNc First Strand Superscript III de Invitrogen. La Q-PCR se realizó utilizando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Todas las muestras se cargaron por duplicado o triplicado en el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX ConnectTM. Se utilizó 18s para normalizar la expresión del ARNm. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla complementaria 4.

La proteína total se aisló de riñones o células utilizando un tampón de lisis elaborado mezclando el reactivo de extracción de proteínas tisulares T-PER (Invitrogen, n.° de catálogo 78510) con una tableta inhibidora de proteasa fosfatasa (Fisher, n.° de catálogo PIA32961) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampón de lisis se preparó y almacenó como alícuotas únicas a -80 °C. Las alícuotas se descongelaron en hielo inmediatamente antes del aislamiento de proteínas. La concentración de proteínas se midió utilizando el reactivo del ensayo Bradford. Se prepararon muestras de proteínas en tampón de muestra NuPAGE LDS 4X con b-mercaptoetanol al 0,5% (Sigma, n.º de catálogo M6250) para todas las proteínas, excepto PC1 y PC2 y su beta-actina de control de carga, que se prepararon con DTT 0,1 M (Sigma, catálogo #D0632). Las muestras siempre estaban recién preparadas antes de la electroforesis en gel. Las muestras de BME se hirvieron durante 5 minutos a 98 °C antes de cargarlas en geles. Las muestras de DTT se incubaron a 25 °C durante 10 minutos antes de cargarlas en geles.

Para la detección de PC1 de longitud completa, las muestras se procesaron en el gel de proteína de tris-acetato al 3–8 % NuPAGE™ (Invitrogen, EA03785) a 160 V durante 1,5 h en hielo. En cada gel se utilizó una escalera de proteínas de alto peso molecular (Invitrogen, n.º de catálogo LC5699) para rastrear proteínas de 460 kDa. Las proteínas separadas electroforéticamente se transfirieron utilizando el sistema de transferencia Invitrogen a 200 mA durante 100 minutos en hielo o a 4 °C. Las muestras que contenían 10 µg de proteína se procesaron en geles prefabricados de poliacrilamida mini-PROTEAN SDS para detectar otras proteínas. En cada gel se utilizó una escalera de peso molecular estándar para realizar un seguimiento del tamaño de las proteínas. Los geles se procesaron a 150 V hasta que se acabó el tinte. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el sistema Trans-Blot Semi-Dry Transfer en el programa MW mixto.

Después de completar la transferencia, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % y se sondaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios. Las membranas se lavaron tres veces con 1x TBS-Tween a la mañana siguiente antes y después de sondear durante una hora con un anticuerpo secundario. Como anticuerpo secundario se utilizó IgG conjugada con HRP de cabra-anti-conejo o anti-ratón. Se utilizó anticuerpo de actina conjugado con HRP (Sigma, n.º de catálogo a3854) para medir la proteína total. Las transferencias se revelaron utilizando el sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal West Dura, ECL o Femto de Pierce. Las transferencias se revelaron utilizando el generador de imágenes digital Bio-Rad. Las bandas de proteínas se cuantificaron utilizando el software Imagelab de Bio-Rad. Cada transferencia Western se repitió al menos tres veces. Se procesaron diez microgramos de proteína de células o riñones en geles para detectar proteínas <150 kDa. Se procesaron entre 40 y 60 µg de proteína en geles para detectar la proteína PC1 de longitud completa y peso molecular pesado (462 kDa). Todos los anticuerpos primarios se usaron en una dilución de 1:1000, excepto PC1 (usado en 1:500), y los anticuerpos secundarios se usaron en una dilución de 1:5000. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: PC1 (7E12 Santa Cruz, n.º de catálogo sc-130554); PC1 E8-8C3C10 (centro central de Baltimore PKD), PC2 (obsequio del Baltimore PKD Core); pCREB (Señalización Celular, catálogo n.° 9198); c-Myc (Abcam, catálogo n.° ab185656), YAP1 (Señalización celular, catálogo n.° 4912); Mettl3 (Invitrogen, n.º de catálogo MA5-27527).

Se utilizaron secciones de parafina de tejidos renales para la tinción por inmunofluorescencia. Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron horneando primero a 60 °C durante 1 h y luego lavándolos en Histo-clear (Fisher, HS-2001) tres veces durante 5 minutos cada uno. A continuación, los portaobjetos se rehidrataron mediante lavados con etanol al 100 %, 95 % y 70 % antes de la incubación en PBS 1X. Luego, los portaobjetos se sometieron a recuperación de antígeno con citrato de sodio. Los portaobjetos se trataron con borohidruro de sodio para apagar la autofluorescencia durante 40 minutos. Los portaobjetos se lavaron en PBS 1X tres veces y luego se bloquearon en PBS 1X + suero de cabra al 10 % + BSA al 0,1 % (bloque de anticuerpos) durante al menos 1-2 h a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche. Los anticuerpos primarios se diluyeron con bloque de anticuerpos a una dilución de 1:500. Los portaobjetos se lavaron en PBS 1X tres veces durante 5 minutos cada uno, se trataron con anticuerpos secundarios Alexa Fluor (diluidos usando el bloque de anticuerpos a una dilución 1:500) durante 1 h y luego se lavaron tres veces durante 5 minutos cada uno. Los portaobjetos se montaron utilizando Vecta Shield que contenía Dapi. Se tomaron imágenes de los portaobjetos utilizando el microscopio de luz compuesta Zeiss o el escáner de portaobjetos Zeiss Axioscan Z1. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: DBA (Vector Labs, n.° de catálogo B-1035), THP (Biomedical Technologies, n.° de catálogo BT-590), LTA (Vector Labs, n.° de catálogo B-1325), MRC1 (Abcam, n.° de catálogo ab64693) , pCREB1 (Cell Signaling, catálogo n.° 9198) y pHH3 (Sigma, catálogo n.° H0412). El procesamiento, la inmunotinción y la obtención de imágenes de los portaobjetos se realizaron simultáneamente en cada experimento.

La tinción por inmunofluorescencia se realizó en células cultivadas en portaobjetos de 8 cámaras (Fisher, n.º de catálogo 154534PK). Las células se fijaron con metanol 100% helado durante 5 minutos a 4 °C. Los portaobjetos se lavaron con PBS 1X 3 veces durante 5 min. Luego, las células se bloquearon en 1X PBS + suero de cabra al 10 % + BSA al 0,1 % + glicina 0,1 M + Tween 20 al 0,1 % (bloque de anticuerpos) durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se diluyeron con un bloque de anticuerpos a una dilución de 1:100 y se agregaron a los portaobjetos durante 2 h. Los portaobjetos se lavaron en PBS 1X tres veces durante 5 minutos cada uno, se trataron con anticuerpos secundarios Alexa Fluor (diluidos usando el bloque de anticuerpos a una dilución 1:500) durante 1 h y luego se lavaron tres veces durante 5 minutos cada uno. Los portaobjetos se contratiñeron en DAPI (Fisher, n.º de catálogo ICN15757410) diluido a 1:10000 en agua destilada durante 10 minutos antes de obtener imágenes con un microscopio de luz compuesta Zeiss. Para cada experimento, las células de control y de tratamiento o las células de control y ∆17 se sembraron simultáneamente en diferentes cámaras del mismo portaobjetos. También se realizaron simultáneamente el procesamiento, la inmunotinción y la obtención de imágenes de los portaobjetos.

Se utilizó MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher, n.º de catálogo M7512) para analizar el potencial de membrana mitocondrial en células vivas. El producto MitoTracker® liofilizado se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta una concentración final de 1 mM y se almacenó a -20 °C en pequeñas alícuotas. Las células cultivadas hasta una confluencia del 40 al 70% se lavaron con PBS estéril y luego se trataron con medio normal DMEM sin suero que contenía MitoTracker 100 nM durante 8 minutos. Inmediatamente después, el medio se reemplazó con medio de crecimiento normal y se tomaron imágenes con un microscopio de luz compuesta Zeiss. Las imágenes fueron tomadas al mismo tiempo de exposición para las muestras del mismo experimento. La intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional al potencial de membrana.

Se esparcieron 25 µl de Matrigel 100 % (Fisher, n.º de catálogo 354234) en cada pocillo de un portaobjetos de 8 cámaras con puntas de pipeta estériles de 200 µl preenfriadas. Luego se colocó la placa en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos para que se endureciera el Matrigel. Mientras tanto, las células se tripsinizaron, se lavaron una vez con PBS, se filtraron a través de un colador celular de 40 µm para crear una suspensión unicelular y se contaron. Las células se sembraron en el portaobjetos recubierto de Matrigel a una densidad de siembra de 5000 células/pocillo en un volumen de 300 µl de medio de crecimiento que contenía Matrigel al 2 %. Para cada línea celular o condición de tratamiento, las células se sembraron por triplicado y se incubaron a 37 °C durante 7 días para permitir el crecimiento de quistes 3D en suspensión. Durante este tiempo, los pozos se complementaron con medio de crecimiento 72 h después de la colocación inicial en Matrigel. El día 7, se tomaron imágenes de los portaobjetos de la cámara en un microscopio óptico Leica DMI 3000B. Las imágenes se analizaron utilizando el software ImageJ para obtener mediciones del tamaño del quiste. Cada ensayo se repitió al menos tres veces. Las mediciones de cada experimento se combinaron y analizaron para determinar su significación estadística.

Ratones hembra con potencial Pkd1+/+; Los embriones Pkd1∆17/+ y Pkd1∆17/∆17 se diseccionaron en el día embrionario (E) 13,5 en PBS para recolectar los riñones y la cola. La cola de cada embrión se utilizó para la extracción de ADN y posterior genotipado. Los riñones se prepararon para cultivo en membranas Whatman (Sigma, número de catálogo WHA110409) en una interfaz aire-medio como se describe28. Los riñones se cultivaron en DMEM basal (Thermo Fisher, n.° de catálogo 12500) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 %, PenStrep al 2 % (Invitrogen, n.° de catálogo 1514022), 5 μg/ml de insulina, 5 μg/ml de transferrina, 2,8 nM. selenito de sodio, 25 ng/ml de prostaglandina E y 32 pg/ml de T3. Se cultivó un riñón en los medios anteriores y el riñón contralateral se cultivó en medios suplementados con 8-Br-cAMP (Sigma, n.º de catálogo B7880) 100 µM. Utilizando una segunda cohorte de ratones, se cultivó un riñón en 8-Br-c-AMP 100 µM o 8-Br-c-AMP 100 µM + SAM 250 µM. Para todos los cultivos, los medios se cambiaron cada 48 h. Se tomaron imágenes de los cultivos en vivo usando el microscopio Zeiss Stereo Lumar el día 4. Los quistes se midieron y analizaron usando el software ImageJ. Al final de los 6 días, los riñones se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior para la extracción de ARN o proteínas.

Se sembraron células Pkd1RC/- y Pkd1RC∆17/- (densidad 3 x 10^3) en placas de 96 pocillos. A la mañana siguiente, se cambió el medio para que contuviera reactivo alamarBlue 1X (Invitrogen, n.º de catálogo DAL1025) y vehículo, 8-Br-cAMP 100 µM, SAM 100 µM o glucosa 17 mM. Se tomaron lecturas colorimétricas a 570 nm y 600 nm en un lector de microplacas después de 12 h. La reacción redox de alamarBlue se utilizó para evaluar cuantitativamente la proliferación celular. Se utilizó N = 8 para cada condición. Los valores se trazaron como un mapa de calor escalado utilizando el paquete Python MatplotLib. Se utilizó el mismo enfoque experimental para Pkd1RC∆/-; células Pkd2∆17/∆17 y las células de control Pkd1RC/-; Pkd2+/+.

La creatinina sérica se midió mediante electroforesis capilar en el Centro O'Brien de UT Southwestern. BUN se midió con el analizador Vitros250 de UT Southwestern Metabolic Phenotyping Core.

El ARN total se extrajo de los riñones utilizando mini kits miRNeasy (Qiagen). La pequeña fracción de ARN (<300 nucleótidos) se hibridó en un chip de microfluidos μParaflo que contenía sondas de detección para todos los microARN de ratón (miARN) en miRBase versión-17 (miRBase, //microrna.sanger.ac.uk/sequences). Los chips de microarrays hibridados se marcaron con tintes fluorescentes y se escanearon con láser para obtener imágenes fluorescentes. Los valores de señal para cada muestra se obtuvieron mediante resta y normalización de fondo. LC Sciences realizó la hibridación de chips de microarrays, el etiquetado fluorescente, el escaneo láser y la resta y normalización del fondo. Se promediaron los valores de señal de cada uno de los cinco grupos de edad (P2, P7, P14, P35) y se calcularon los valores de P utilizando ANOVA unidireccional. Las señales detectadas diferencialmente se definen por P <0,05.

El control de calidad de la secuenciación se realizó con FastQC v0.11.8. Las lecturas de RNA-seq se recortaron y las lecturas de baja calidad se eliminaron utilizando Trimgalore v0.6.3_dev (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) con el parámetro "emparejado" y una longitud de 150 bps. Las secuencias fastq recortadas se alinearon con el genoma de referencia del ratón GRCm38 usando STAR aligner v2.5.3a con los archivos bam producidos ordenados por coordenadas usando la opción “--outSAMtype BAM SortedByCoordinate. 56,57“ Los recuentos de genes de lectura sin procesar se obtuvieron utilizando el alineador STAR con las opciones “—quantMode GeneCounts” y “--sjdbGTFfile” con modelos genéticos en formato GTF obtenidos de la versión 94 de EnsEMBL de ratón. El control de calidad de la alineación y las estadísticas de mapeo de lectura se obtuvieron de Herramientas Picard v2.20.3 utilizando la función “CollectMultipleMetrics” (http://broadinstitute.github.io/picard/).

Se utilizaron recuentos de genes sin procesar para control de calidad y análisis de expresión diferencial. Los recuentos sin procesar se normalizaron al número total de lecturas calculando log2CPM (recuentos por millón). Examinamos cuidadosamente la distribución de log2CPM y su relación con la desviación estándar y determinamos el límite apropiado (log2CPM promedio <-3) para eliminar genes de baja expresión antes del análisis diferencial de expresión génica. La cuantificación de TPM (transcripción por millón) se realizó utilizando RSEM v1.3.1 y el análisis diferencial de expresión génica se realizó utilizando limma-trend (versión 3.40.6) en R58,59.

La cuantificación de la transcripción de Pkd1 individual se realizó utilizando Salmon v1.3.060. Las cinco versiones diferentes de transcripción para Pkd1 se agregaron al transcriptoma de referencia fasta RefSeq mm9 para construir un nuevo índice Salmon. Luego, los archivos fastq se mapearon directamente y se leyeron los recuentos, y los valores de TPM se cuantificaron con el proceso estándar.

Se sembraron células Pkd1RC / - en confluencia 2 × 10 ^ 5 en placas de 6 pocillos. A la mañana siguiente, las células se transfectaron usando Lipofectamine 3000 con un vehículo, oligonucleótido de control o RGLS4326 a una concentración final de 100 µM. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células para la extracción de ARN. Setenta y dos horas después de la transfección, las células se recolectaron para obtener proteínas o se sembraron adicionalmente para el ensayo alamarBlue y el ensayo de cistogénesis 3D. Para el experimento que se muestra en la Fig. 5C, el ensayo de cistogénesis 3D se realizó con células Pkd1RC/- no tratadas, como se describe en la sección de métodos del ensayo de cistogénesis 3D con los siguientes cambios. El día 4 del cultivo de Matrigel, se tomaron imágenes de los pocillos utilizando el microscopio óptico Leica DMI 3000B y luego los cultivos se transfectaron con un vehículo, un oligonucleótido de control 100 µM o RGLS4326 100 µM y se cultivaron durante 3 días adicionales. El día 7, las muestras se sometieron a imágenes para evaluar el tamaño del quiste.

El KspCre; Para los estudios de fármacos se utilizó la línea de ratones Pkd1F/RC. Los ratones fueron asignados al azar y se les administró 20 mg kg-1 de vehículo (PBS), oligonucleótido de control o RGLS4326 mediante inyecciones subcutáneas. Para el primer estudio de prevención de quistes (Fig. 5D-G), se inyectó a los ratones en los días posnatales (P) 10, P11, P12 y P16 y se sacrificaron en P18. También se sacrificaron ratones no transgénicos de cepas compatibles en los mismos días. Para el segundo estudio de estabilización de la enfermedad (Fig. 5H-K), se inyectaron ratones en P16 y P17 y se sacrificaron en P26. Un ratón del estudio sucumbió a la enfermedad y murió antes de los 26 días de edad. Para el tercer estudio a largo plazo (Fig. 5L-N), se inyectó a los ratones en P16 y P17 y luego cada semana hasta las 18 semanas de edad. Otra cohorte de ratones recibió la misma dosis de tratamiento con RGLS4326 en P16 y P17 y luego quincenalmente hasta las 18 semanas de edad. Los ratones fueron observados todos los días durante 18 semanas para observar su muerte. Al final de las 18 semanas, los ratones supervivientes fueron sacrificados para recolectar tejido. En todos los grupos de estudio se utilizó un número igual de hombres y mujeres.

Las células primarias de quiste de ADPKD humana se obtuvieron de PKD Research Biomarker and Biomaterial Core en el Centro Médico de la Universidad de Kansas (KUMC). El uso de tejidos renales descartados quirúrgicamente cumplió con las regulaciones federales y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad de Kansas. Ambry Genetics (Aliso Viejo, CA) realizó el análisis de mutaciones PKD1 y PKD2 del ADN de células quísticas de donantes. Cada línea celular primaria se cultivó en DMEM/F12 + + (Gibco, n.° de catálogo 10565–018) suplementado con 10 % de FBS, 5 μg kg-1 de insulina, 5 μg mL-1 de transferrina y 5 ng mL-1 de selenito sódico y Se incubaron en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO2 a 37 °C hasta un 80% de confluencia. En el segundo pase, las células de cada donante humano se sometieron a transfección inversa utilizando reactivo CRISPRMAX (Invitrogen) que contenía proteína Cas9 (IDT) y sgRNA sintéticos (IDT) o se transfectaron con vehículo (sin Cas9). Los cultivos transfectados con Cas9/sgRNA son una población mixta de células editadas y no editadas. La propagación clonal no fue posible porque se trata de células primarias que sólo permiten un número limitado de pases. Luego se sembraron células transfectadas con Cas9 o vehículo (control) en placas de 6 pocillos y portaobjetos de cámara. Después de 72 h, las células se recogieron para genotipado, análisis de transferencia Western y tinción por inmunofluorescencia/MitoTracker. Además, a las 72 h después de la transfección, las células se tripsinizaron y se sembraron con una densidad de 4000 células/pocillo en 200 µl de medio más Matrigel (Corning, n.° de catálogo 354234) en una placa de 96 pocillos (Corning, n.° de catálogo 353072). Los medios se repusieron 72 h después de la colocación inicial en Matrigel. Las imágenes de quistes se obtuvieron el séptimo día del cultivo de Matrigel (décimo día después de Cas9/SgRNA o transfección con vehículo). Se obtuvieron cien imágenes de quistes para células transfectadas con Cas9 o con vehículo de cada donante. De manera similar, 72 h después de la transfección, se sembraron células con una densidad de 2000 células/pocillo en placas de 96 pocillos para el ensayo de proliferación de alamarBlue. Al día siguiente, el medio se reemplazó con medio de crecimiento que contenía 1X alamarBlue y se tomaron lecturas 12 h después.

Todos los experimentos se llevaron a cabo con al menos tres réplicas biológicas y mostraron una reproducibilidad exitosa. Para experimentos in vivo, N es el número de ratones analizados. Para experimentos in vitro, N se refiere al número de réplicas biológicas. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para comparaciones por pares y análisis de varianza (ANOVA), seguida de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se utilizó la prueba de Mantel-Cox para el análisis de la supervivencia del ratón. Todos los datos se analizaron utilizando el software Prism (software GraphPad). P <0,05 se consideró estadísticamente significativo. El tamaño de la muestra y los valores de P se mencionan en los gráficos de las figuras, las leyendas de las figuras o la sección de resultados. Para los estudios RGLS4326, los animales fueron asignados aleatoriamente a los brazos de tratamiento. Los investigadores no desconocían el tratamiento ni los genotipos de los animales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud. Los conjuntos de datos de RNA-seq se han depositado en el repositorio Omnibus de expresión genética del NCBI con el número de acceso GSE196237. El conjunto de datos de microarrays se ha depositado en el repositorio NCBI Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE208429. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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El trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01DK102572) y el Departamento de Defensa (D01 W81XWH1810673) para VP RL cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Salud (K08DK117049) y subvenciones de la Fundación PKD y la Sociedad Estadounidense de Nefrología. Programa de subvenciones KidneyCure. Agradecemos al Centro Central de Investigación Renal O'Brien (P30DK079328) de UT Southwestern Medical Center, al Centro Eugene McDermott para el Centro de Secuenciación y Desarrollo Humano y al Laboratorio de Bioinformática de UT Southwestern, al Centro de Patología Molecular de UT Southwestern, al Centro de Microscopía de Cerebro Completo de UT Southwestern Facility, Genewiz y Monoceros por proporcionar reactivos y servicios críticos. La PQRAD humana y las células y tejidos de riñón humano normal fueron proporcionados por el núcleo de modelos de biomarcadores y biomateriales de PKD, ubicado en el Centro Médico de la Universidad de Kansas. El Núcleo es parte del Consorcio de Recursos de Investigación de PKD, apoyado por los Institutos Nacionales de Salud/NIDDK (U54 DK126126).

Estos autores contribuyeron igualmente: Ronak Lakhia, Harini Ramalingam.

Departamento de Medicina Interna, Nefrología, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, EE. UU.

Ronak Lakhia, Harini Ramalingam, Chun-Mien Chang, Patricia Cobo-Stark, Laurence Biggers, Andrea Flaten, Jesús Álvarez y Vishal Patel

Regulus Therapeutics Inc., San Diego, CA, 92121, EE. UU.

Tania Valencia & Edmund C. Lee

Departamento de Medicina Interna y Instituto del Riñón Jared Grantham, Centro Médico de la Universidad de Kansas, Kansas City, KS, EE. UU.

Darren P. Wallace

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RL, HR, CC y VP diseñaron, realizaron experimentos y/o analizaron datos que involucraban eliminaciones del motivo miR-17. AF, TV, EL, CM, HR, RL y VP diseñaron, realizaron experimentos y/o analizaron datos relacionados con estudios RGLS4326. DW proporcionó células humanas de PQRAD. PC, JA, HR, RL y VP diseñaron, realizaron experimentos y/o analizaron datos que involucraban células humanas de PQRAD. HR, RL y VP prepararon las cifras; VP escribió el manuscrito con contribuciones de HR y RL

Correspondencia a Vishal Patel.

VP tiene patentes relacionadas con anti-miR-17 para el tratamiento de ADPKD (16/466,752 y 15/753,865). VP se desempeña como consultor científico para Otsuka Pharmaceuticals, Maze Therapeutics y Regulus Therapeutics. VP Lab tiene un acuerdo de investigación patrocinado con Regulus Therapeutics. VP lab también tiene un acuerdo de investigación patrocinado con Sanofi SA, Myonid Therapeutics y Vifor Pharmaceuticals, que no están relacionados con este trabajo. TV y E L. son empleados de Regulus Therapeutics. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Lakhia, R., Ramalingam, H., Chang, CM. et al. La inhibición cis del ARNm de PKD1 y PKD2 impulsa la progresión de la enfermedad renal poliquística. Nat Comuna 13, 4765 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32543-2

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Recibido: 27 de enero de 2022

Aceptado: 04 de agosto de 2022

Publicado: 15 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32543-2

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