Más allá de la espora, la antrosa de azúcar del exosporio afecta la regulación del gen vegetativo del Bacillus anthracis en cis y trans.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 5060 (2023) Citar este artículo

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La siesta de Bacillus anthracis exosporium es la porción más externa de la espora que interactúa con el medio ambiente y los sistemas huésped. Los cambios en esta capa tienen el potencial de afectar una amplia gama de procesos fisiológicos e inmunológicos. El azúcar único, la antrosa, normalmente recubre la pelusa del exosporio en sus puntos más distales. Anteriormente identificamos mecanismos adicionales que hacen que la antrosa de B. anthracis sea negativa. En este trabajo, se identifican varias cepas nuevas de hormiga B. anthracis y se investiga el impacto de la negatividad de la antrosa en la fisiología de las esporas. Demostramos que las vacunas vivas atenuadas de Sterne, así como las vacunas contra el ántrax con filtrado de cultivo, generan anticuerpos dirigidos a componentes no proteicos de la espora. El papel de la antrosa como molécula de señalización vegetativa de B. anthracis Sterne está implicado por ensayos de cepas de expresión luminiscente, experimentos de secuencia de ARN y análisis de secreción de toxinas mediante transferencia Western. La antrosa pura y el análogo de nucleósido decoyinina, que induce la esporulación, tuvieron efectos similares sobre la expresión de la toxina. Los experimentos de cocultivo demostraron que los cambios en la expresión génica en B. anthracis dependen del estado de la antrosa intracelular (cis) además del estado de la antrosa de las interacciones extracelulares (trans). Estos hallazgos proporcionan un mecanismo de cómo un residuo de azúcar específico de esporas afecta la fisiología, la expresión y la genética de B. anthracis vegetativo con impactos en la ecología, patogénesis y vacunología del ántrax.

La bacteria Bacillus anthracis causa el ántrax y puede sobrevivir en condiciones ambientales adversas formando una espora1. Rodeando la endospora hay una capa de proteína suelta, rica en carbohidratos, denominada exosporio2. Durante la esporulación, el exosporio se ensambla alrededor de la espora mientras se forma en la célula madre mediante un esfuerzo coordinado de las proteínas CotE, CotO y CotY3. La porción exterior del exosporio está compuesta de glicoproteínas que crean una capa similar a un velcro conocida como pelo de exosporio. La pelusa contiene tallos sobresalientes de las proteínas BclA y BclB glicosiladas unidas a las proteínas de la capa basal ExsFA/BxpB y ExsFB4,5. La siesta de glicoproteína exosporium imparte una superficie cargada a la espora y es la superficie distal que media las interacciones entre las esporas inactivas y el entorno externo, incluidas las partículas del suelo, las células huésped animales y otras esporas. Tras la germinación, el exosporio se desprende y B. anthracis comienza a germinar, luego se replica en forma vegetativa mientras secreta la toxina del ántrax6.

Se han identificado ocho proteínas como componentes importantes del exosporio cuando se preparan a partir de exosporio lavado para eliminar cualquier proteína de células vegetativas7. La proteína BclA es el componente proteico principal del exosporio y forma fibras en forma de tallo que sobresalen de la superficie del exosporio. Las regiones repetidas similares a colágeno de BclA varían en longitud entre cepas de B. anthracis dependiendo del tamaño del gen bclA. Estos polimorfismos contribuyen a cambios observables en el espesor de la pelusa en la superficie de las esporas8. BclA está presente en formaciones triméricas donde las regiones similares al colágeno están densamente glicosiladas con repeticiones de pentasacáridos de GalNAc-Rha-Rha-Rha-Ant9. La hormiga es el monosacárido antrosa y es un azúcar raro que se encuentra en pocos lugares de la naturaleza. El operón biosintético de antrosa ha sido bien caracterizado y está compuesto por cuatro genes antA, antB, antC y antD10,11. Todos los genes están involucrados en la biosíntesis de antros con la eliminación de antA que reduce la antros de esporas medibles a la mitad y la eliminación de antB, antC o antD elimina los niveles detectables de esporas de antros11. Anthrose no es sintetizada por otras Bacillus spp. y por eso está presente de manera única en la superficie de las esporas de B. anthracis. Se encuentran residuos de azúcares alternativos en las esporas de otras Bacillus spp, como la cereosa presente en las esporas de Bacillus cereus12,13. Aunque BclA se encuentra en la superficie del exosporio, su contribución a la patogénesis no está clara. No se requirió BclA para una virulencia total en experimentos de exposición a ratones con dosis altas de Sterne4 o Ames14, mientras que en otro estudio, un mutante ΔbclA Sterne 34F2 tuvo una reducción del 50 al 70% en LD50 en comparación con el Sterne 34F215 de tipo salvaje. El diseño del estudio de dosis altas puede enmascarar los efectos de virulencia de la eliminación de bclA con toxina fulminante y producción de cápsulas que pueden revelarse en estudios de LD50 más sensibles. Es importante destacar que una eliminación de BclA elimina eficazmente la antrosa de la superficie de las esporas, dejando intacta su biosíntesis en las células vegetativas. Se ha demostrado que eliminar BclA aumenta la asociación con células epiteliales, fibroblastos y células endoteliales, pero no con macrófagos16. Esto fue corroborado por otros que mostraron que las esporas knockout de BclA no podían unirse al receptor CD14 de macrófagos, mientras que la eliminación de antrosa de BclA en las esporas knockout de antC/degT aumentaba la unión al receptor CD14 al revelar los residuos de ramnosa17. Esto concuerda con los hallazgos de que los ratones expuestos a esporas mutantes de bclA retienen más esporas en el líquido pulmonar broncoalveolar después de la exposición al aerosol14. La función precisa de la antros y su contribución a la patogénesis aún no está clara, y hay evidencia que respalda la interacción con el entorno del suelo y las células del sistema inmunológico. Anteriormente, descubrimos que eliminar la antros de la superficie de las esporas reducía la eficiencia de la germinación y aumentaba las tasas de esporulación en un modelo heterólogo de B. anthracis Sterne18. Además de los cambios fisiológicos, las esporas negativas de antros tenían la mitad de la LD50 en un modelo de exposición subcutánea en ratón, lo que provocó un tiempo de muerte más rápido y una diseminación más rápida en los órganos del huésped. También se observó un aumento de la letalidad en un segundo modelo animal al desafiar larvas de Galleria mellonella con esporas18.

Anteriormente se pensaba que la falta de anthrose se limitaba a un subgrupo de B. anthracis único aislado en Chad, Mali, Camerún19 y Nigeria, acertadamente denominado Grupo de África Occidental (WAG)20. Estas cepas tienen un SNP conservado y un evento de triplicación de nucleótidos que las convierte en hormigas. Anteriormente identificamos dos cepas de B. anthracis genéticamente hormigas, mediante deleciones cromosómicas que abarcan la totalidad del operón biosintético de antrosa, una de Chile y otra de Polonia, en nuestra colección global de B. anthracis18,21. Una búsqueda de registros de secuencia disponibles públicamente indicó que la cepa de heroína Ba4599 de B. anthracis, que se aisló de un caso europeo de ántrax vinculado a heroína contaminada con esporas de B. anthracis, tenía un nuevo SNP vinculado al genotipo de hormiga. Estas tres observaciones ampliaron los mecanismos y la distribución geográfica de las cepas negativas de antros más allá de las observaciones originales del WAG, lo que hizo más urgente comprender sus orígenes geográficos y las implicaciones de la pérdida de esporas de antros.

Aquí analizamos la negatividad de la antrosa comenzando desde una perspectiva epidemiológica, ya que entendemos la amplitud de las mutaciones acumuladas de la antrosa. Al examinar los archivos de secuenciación de próxima generación depositados recientemente, ampliamos nuestro conocimiento de la distribución geográfica de las cepas negativas de antros y las asociamos con brotes de importancia para la salud pública. Esto proporciona el contexto para analizar el papel que puede desempeñar la antrosa en la célula y cómo B. anthracis se ve afectada por su ausencia. Comprender las consecuencias de la pérdida de antrosa en las propiedades físicas de la espora indicaría si la antrosa imparte propiedades innatas a la siesta de exosporio. Además de las propiedades físicas de la superficie de las esporas, muchas bacterias responden a metabolitos biosintéticos, como la lactosa o la arabinosa, y modifican la expresión genética en consecuencia. Muchos estudios previos eliminaron BclA de la superficie de la espora mediante mutación genética, lo que no afectaría la producción de antrosa en la célula hacia la esporulación. Para analizar el papel de la antrosa en la fisiología de las células bacterianas, en este trabajo nos centramos en comparar mutantes de antrosa y de tipo salvaje. Intentamos caracterizar los cambios globales en la expresión genética en respuesta al monosacárido único que adorna las esporas, la antrosa. Anthrose podría causar cambios en el transcriptoma de B. anthracis durante el crecimiento vegetativo al servir como inductor o represor genético como parte del flujo metabólico que ocurre a lo largo del camino hacia la esporulación. Esto serviría como una presión selectiva activa para la mutación del operón de la antrosa durante el crecimiento vegetativo. Más específicamente, importantes mecanismos de virulencia asociados con el crecimiento vegetativo, como la secreción de toxinas, pueden verse afectados por el flujo de antrosa. Se utilizó RNA-seq en asociación con experimentos de cepas informadoras luminiscentes para sondear la expresión génica en presencia de antrosa. Una mirada más cercana a las propiedades inmunológicas modificadas de la espora proporciona más evidencia de que la modificación del epítopo de la superficie de la espora puede evadir las respuestas inmunes asociadas. Produjimos varias cepas reporteras luminiscentes en el fondo de B. anthracis Sterne para caracterizar el efecto del estado de antros en la inducción de genes a lo largo del tiempo. El tratamiento de reporteros luminiscentes de B. anthracis con antrosa purificada y decoyinina (un inhibidor de la GMP sintasa que induce la esporulación de Bacillus producido por Streptomyces) reveló diferencias regulatorias en las cepas positivas y negativas de antrosa. Finalmente, se utilizó el cocultivo de reporteros luminiscentes con cepas positivas y negativas de antrosa para investigar si los niveles de antrosa nativa cambiaban la expresión genética en las células vecinas. En conjunto, este trabajo enmarca la negatividad de la antrosa como una mutación fenotípica que puede afectar la fisiología de B. anthracis vegetativa al tiempo que cambia la estructura de la espora.

Una revisión de nuestro trabajo anterior y un análisis en profundidad revela varios mecanismos genéticos para la pérdida de antros. Junto con estos diversos mecanismos, la distribución geográfica de las cepas de hormigas es amplia (en al menos 15 países) y de larga duración (más de 70 años). El análisis de las cepas de hormigas conocidas en relación con varias cepas tipo y otras cepas de B. anthracis de interés mediante la comparación de SNP del genoma completo muestra su relación con otras cepas tipo B. anthracis y entre sí (Fig. 1). Los colores de las etiquetas representan diferentes linajes de B. anthracis y linajes importantes para este trabajo. El grupo externo Bacillus cereus se agrupó más cerca de la cepa A1055 representativa del grupo C. En la Tabla 1 se presenta un resumen de las firmas genéticas, cepas y datos epidemiológicos relevantes de las hormigas.

Árbol SNP del genoma completo de cepas conocidas de hormigas - Bacillus anthracis en relación con otros linajes de B. anthracis. Varios grupos y linajes de B. anthracis de interés para este trabajo están etiquetados en el lado derecho de la figura. Los puntos naranjas indican cepas de nuestra colección que son negativas para antros. Las etiquetas de diferentes colores sirven para ayudar a diferenciar los linajes. Las etiquetas de las ramas resaltadas en rojo indican cepas de B. anthracis que son negativas para la antrosa mediante el interrogatorio de la secuencia del genoma completo. B. cereus es anthrose negativo de forma nativa, no debido a mutaciones discretas, por lo que la rama no está resaltada en rojo. Las longitudes de las ramas se indican encima de las ramas con valores de arranque de 100 ubicados debajo. El árbol tiene sus raíces en el grupo externo B. cereus. Diversas cepas de todos los linajes están adquiriendo negatividad de antrosa de formas diversas e independientes. El árbol filogenético de SNP del genoma completo en esta figura se produjo mediante análisis con PhaME54 y se visualizó con iTOL55.

Para observar la alteración física de la siesta de exosporio que se produce en ausencia de antrosa, se llevó a cabo microscopía electrónica de transmisión de las esporas. Las esporas preparadas a partir de B. anthracis Sterne WT, B. anthracis Sterne ΔantC y B. anthracis Sterne ΔantC/COMP se fijaron y se sometieron a congelación a alta presión y luego se observaron con un aumento de 15 000 × (Fig. S1A-F). La siesta de exosporio de diez imágenes de esporas de dos preparaciones diferentes se peló digitalmente para linealizar y visualizar un mapa de calor topográfico en 3D (Fig. 2A-C). Cualitativamente, las imágenes muestran que la siesta de la cepa WT es más densa en electrones (más púrpura) en comparación con el mutante ΔantC negativo de antrosa (Fig. 2C). Las esporas del complemento de antrosa tienen regiones de pelusa muy densas que generalmente tenían una densidad más irregular en toda la espora. Se generaron histogramas como medida del área de píxeles a partir de las imágenes de siesta linealizadas y se utilizaron para comparar cuantitativamente la densidad de la fibra de exosporio entre cepas (Fig. 2D). Los datos mostraron que la densidad de las fibras de la siesta de exosporio era la más baja en el mutante ΔantC, mientras que WT y ΔantC/COMP tenían densidades similares.

Análisis del exosporio mediante trazado de superficie topográfica de fibras y Western blot. (A) Un ejemplo de una imagen de espora única que se analizó usando Fiji para "pelar" la capa de pelo de exosporio de la superficie de la espora. (B) Diez esporas de B. anthracis Sterne WT, ΔantC, ΔantC/COMP seleccionadas al azar tenían su siesta de exosporio dispuesta. (C) Estas mismas diez esporas convirtieron sus capas de siesta en un gráfico topográfico de superficie 3D para facilitar la visualización de la densidad de electrones asociada con las imágenes TEM. (D) Las imágenes en blanco y negro en (B) se convirtieron en histogramas y se determinaron sus áreas. *p < 0,05; ns = no significativo. Se muestran valores individuales, promedios e IC del 95%. (E) Se utilizó Ab policlonal a rBclA para transferir 1 x 107 esporas purificadas de cada cepa. La flecha roja indica una ligera disminución en el peso molecular asociada con la eliminación de antrosa. (F) Las mismas preparaciones de esporas en (E) se transfirieron contra suero AVA humano combinado, lo que indica reactividad inmune al antígeno de esporas. Las regiones de alto peso molecular que coinciden con la reactividad de BclA en (E) se indican mediante corchetes discontinuos.

Se realizaron transferencias Western en un número igual de esporas de la cepa WT, ΔantC o ΔantC/COMP para evaluar si la pérdida de antrosa afectaba el tamaño aparente de BclA y la reactividad con el suero inmune. La eliminación de anthrose podría exponer los epítopos de BclA que de otro modo estarían enmascarados por restos de azúcar hidrofóbicos, con implicaciones en el repertorio inmunológico asociado con las vacunas contra el ántrax. Se utilizó un anticuerpo policlonal contra la proteína BclA recombinante, la proteína decorada con el pentasacárido con punta de antrosa, para detectar el tamaño de la proteína BclA (Fig. 2E). BclA es una proteína de ~ 21 kDa que puede funcionar a > 150 kDa en un gel SDS-PAGE debido a sus numerosas modificaciones de polisacáridos. Un cambio hacia abajo es evidente cuando se secan las esporas que carecen de antrosa (ΔantC). La transferencia de las mismas preparaciones de esporas con suero humano vacunado adsorbido con vacuna contra el ántrax (AVA) combinado muestra que el suero humano tiene una unión moderadamente menor a las esporas de ΔantC en comparación con el WT en la región de alto peso molecular de la región BclA, mientras que tiene una mayor unión en la región de peso molecular más bajo. peso BclA y región PA (Fig. 2F). Para investigar más a fondo la reactividad del suero de la vacuna frente a componentes bacterianos no proteicos en bacterias vegetativas y esporas, se degradó la proteína con proteinasa K y luego se secó con anti-B de conejo. anthracis anticuerpo policlonal, plasma AVA humano combinado, suero de bisonte vacunado con Sterne y suero de bisonte sin tratamiento previo (Fig. S2A-E). El suero de bisonte sin tratamiento previo no reaccionó a todas las muestras analizadas en el gel (Fig. S2D). Las muestras de suero inmune reaccionaron fuertemente con células vegetativas no tratadas (carriles 1) coincidiendo con una proteína que migraba a ~83 kDa; lo mismo que PA (Fig. S2B – D). Los lisados ​​de células vegetativas tratados con proteinasa K para degradar proteínas (carril 2) mostraron poca reactividad con los sueros inmunes. El carril 3 de cada transferencia son lisados ​​de esporas. Las muestras inmunes parecen reaccionar con PA de lisados ​​de esporas. El PA puede unirse al exterior de las esporas22. Están presentes bandas de alto peso molecular específicas de las esporas. Cuando las proteínas se degradan mediante el tratamiento con proteinasa K, un material de alto peso molecular continúa reaccionando con cada muestra inmune. Este material de alto peso molecular resistente a la proteinasa K coincide con la proteína BclA fuertemente glicosilada específica de la espora. La vacuna Sterne es una vacuna de esporas vivas atenuadas, por lo que no es sorprendente que la muestra de suero de bisonte reaccionara fuertemente al antígeno no proteico específico de las esporas (Fig. S2D). La vacuna AVA se produce a partir de un filtrado de cultivo precipitado de una cepa vegetativa no encapsulada de B. anthracis Sterne (al igual que la vacuna precipitada contra el ántrax (AVP)); cepas similares son las esporas vivas atenuadas utilizadas en la vacuna veterinaria23. La cepa de B. anthracis utilizada para la producción de AVA es V770-NP1-R24. Esta cepa se cultiva anaeróbicamente en un fermentador y el filtrado del cultivo se adsorbe en alhidrogel. B. anthracis V770-NP1-R es un derivado pXO2 negativo no proteolítico de la cepa V7701 que se aisló de un caso de ántrax bovino en Florida en 195125. Las transferencias muestran reactividad con material no proteico específico de esporas, lo que indica una pequeña cantidad del antígeno específico de esporas está presente en AVA (Fig. S2E). Un análisis de la vacuna AVP producida de manera similar en el Reino Unido observó esporas en los recipientes de producción de vacunas; sin embargo, los investigadores concluyeron, ante la falta de datos que lo respalden, que esto se debía a que el 30% del inóculo no germinaba26. Los análisis proteómicos de la vacuna AVP encontraron que los componentes principales eran PA (64%), LF (8%) y EF (3%) y otras 258 proteínas que conformaban el 25% restante; los componentes no proteicos no fueron analizados27. BclA es la proteína inmunodominante de la espora y su cambio o modificación, como la eliminación de la antrosa, podría modificar la inmunorreactividad en huéspedes humanos y animales.

Durante el crecimiento del mutante, se observó un aumento de la aglomeración de células en cultivos en caldo en agitación. El análisis microscópico de las células a lo largo del tiempo mostró que el mutante formó cadenas más largas de células vegetativas que generaban estructuras similares a biopelículas a medida que las bacterias esporulaban (Fig. S3), lo que indica un papel global potencial para la detección de antros en la fisiología de B. anthracis. Se secuenció el genoma completo de los mutantes y no se detectaron mutaciones importantes que expliquen el comportamiento observado de nuestro mutante antC.

Los patrones de expresión luminiscentes de importantes promotores de B. anthracis se ven afectados por el estado de la antrosa. Se utilizaron experimentos de crecimiento y expresión luminiscente en HIB + Km10 para caracterizar la expresión de lux de los promotores (A) Pant, (B) PatxA, (C) Plef, (D) PpagA y (E) PsigF durante 48 h. En cada gráfico, el crecimiento (OD a 600 nm; primera columna de gráficos) o la luminiscencia (RLU; segunda columna de gráficos) de Sterne WT está en azul y los mutantes Sterne ΔantC están en rojo. Las imágenes luminiscentes de colonias de placas sólidas a las 24 h están por debajo de los tiempos del caldo. Datos de crecimiento y curva luminiscente de dos experimentos independientes realizados por triplicado con la media y el error estándar de la media en cada momento mostrado.

Se generaron cinco plásmidos indicadores luminiscentes para permitir el análisis de la expresión del promotor del operón antrosa (Pant), el promotor atxA (PatxA), el promotor del factor letal (Plef), el promotor pagA (PpagA) y el promotor sigF (PsigF, también conocido como spoIIAA-). promotor spoIIAB-sigF). Estos plásmidos se conjugaron en B.anthracis Sterne y B.anthracis Sterne ΔantC que previamente verificamos que no podían producir antrosa 18. Las cepas resultantes se cultivaron por triplicado en Heart Infusion Broth (HIB), un medio con alto contenido de proteínas y sin azúcares, y se mancharon. en agar HIB sólido. Las RLU se midieron cada 10 minutos durante 48 h en caldo y se tomaron imágenes a las 24 h en medio sólido (Fig. 3A-E). Eliminar la producción de antrosa cambia la expresión máxima de Pant de 32 a 26 h, lo que indica que la presencia de antrosa puede reprimir la expresión de su propio operón biosintético (Fig. 3A). La expresión de PatxA se reduce considerablemente en el mutante de antrosa (Fig. 3B). Si bien la expresión de Plef y PpagA se retrasó inicialmente en el mutante de antrosa en comparación con WT, los picos grandes a las 24 h indican niveles aumentados de estos componentes de la toxina a medida que el mutante entra en la fase estacionaria (líneas rojas en las figuras 3C y D). Dado que la antrosa está presente en el exosporio de la espora madura, se utilizó el primer factor sigma específico de la preespora, sigF, para medir si la eliminación de la producción de antrosa afectaba este paso dedicado. La expresión de PsigF aumentó a un ritmo más lento en el mutante de antrosa y luego finalmente se acercó a los niveles observados en Sterne WT (Fig. 3E).

Para verificar la participación de la antrosa en la secreción de toxina, se cultivaron cultivos por triplicado de WT Sterne, ΔantC y ΔantC/COMP en matraces de cultivo de 200 ml de inhibidores de proteasa HIB + y se recogieron los sobrenadantes a las 24 h (Fig. 4A). Los sobrenadantes filtrados se analizaron por triplicado mediante transferencia Western para EF, LF y PA. Estos hallazgos indicaron niveles significativamente mayores de EF en el sobrenadante de ΔantC en comparación con WT y el complemento (Fig. 4B). Los niveles de LF en el sobrenadante de ΔantC fueron elevados, aunque no significativamente, en comparación con WT. Los niveles de ΔantC en comparación con ΔantC/COMP fueron significativamente diferentes (Fig. 4C). La tendencia observada con LF se observó en las transferencias PA; sin embargo, la alta variabilidad condujo a diferencias estadísticamente insignificantes (Fig. 4D). Estos datos indican que todos los niveles de toxinas sobrenadantes fueron perturbados por la mutación ΔantC en Sterne; algunos de manera significativa.

El factor de edema, el factor letal y la secreción de antígeno protector por B. anthracis Sterne 34F2 se alteran en ausencia de antrosa. Para confirmar los estudios de expresión luminiscente, las cepas B. anthracis Sterne WT, ΔantC y ΔantC/COMP se cultivaron en HIB + Km 10 en presencia de inhibidores de proteasa en muestras de sobrenadante de 24 h purificadas por filtro por triplicado. Las DO a 600 nm se midieron a lo largo del tiempo (A) y los sobrenadantes se transfirieron para determinar (B) factor de edema, (C) factor letal o (D) antígeno protector. Las intensidades de las bandas individuales, su promedio y la DE se muestran como porcentaje del tipo salvaje (WT). Se ejecutó un ANOVA unidireccional de medidas repetidas en los puntos de tiempo de la curva de crecimiento y las densidades ópticas no fueron significativamente diferentes a las de WT en (A). Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para determinar diferencias significativas de las intensidades de las bandas en (B – D). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

En experimentos preliminares, se descubrió que la ausencia de antrosa en nuestra eliminación genética de Sterne disminuye la expresión de pagA en caldo BHI que contiene glucosa (Fig. 5A y B). Esto contrasta con el gran aumento en la expresión de pagA cuando el mutante ΔantC de Sterne se cultiva en un medio HIB rico en proteínas que no contiene azúcares. Cuando se agregó antrosa exógena durante el crecimiento en caldo BHI, la expresión de PpagA aumentó tanto en WT (línea morada en la Fig. 5A) como en ΔantC Sterne (línea morada en la Fig. 5B). Muchas bacterias responden a niveles de intermediarios metabólicos y modulan la expresión genética en consecuencia. Presumimos que los niveles de antrosa intracelular o extracelular podrían afectar las células vegetativas mediante la modificación de la expresión genética durante el crecimiento vegetativo. B. anthracis Sterne de tipo salvaje se cultivó en presencia y ausencia de antrosa pura añadida exógenamente para evitar cualquier posibilidad de datos confusos en un mutante de deleción. Las bacterias se recolectaron en dos momentos posteriores a la adición de anthrose, 30 min y 2 h, y se compararon con cultivos tratados solo con diluyente (Fig. 5C). Después de 30 minutos de tratamiento, había 6 genes significativamente regulados positivamente más del doble, mientras que 17 genes estaban regulados negativamente (Fig. 5D). Estos genes participaron principalmente en la generación de intermediarios metabólicos como el piruvato y la trehalosa. El gen con mayor regulación positiva fue una supuesta proteína de membrana (log2FC = 10,98) seguida de un gen que codifica un homólogo de GerPF con un log2FC de 10,98. La mutación de las proteínas de la familia GerPF se ha relacionado con un fenotipo de espora superlatente28. El gen que experimentó la mayor regulación negativa fue una supuesta lipoproteína (log2FC = − 20,02). No se detectaron genes localizados en pXO1 a los 30 min. Los genes transcritos diferencialmente desde el punto de tiempo de 30 minutos se enumeran en la Tabla 2. Después de 2 h de tratamiento con antrosa, 52 genes experimentaron una regulación positiva significativa, 18 de los cuales eran proteínas hipotéticas (Fig. 5E). Cuarenta y cinco genes experimentaron una importante regulación a la baja en todas las réplicas, 13 de las cuales eran proteínas hipotéticas. Una proteína regulada por sigma-F específica de esporulación similar a YfhD experimentó un log2FC de 116,33. Las proteínas de la familia YfhD son transglucosilasas implicadas en la degradación de peptidoglicanos. Este gen se expresa en la prespora de Bacillus subtilis29 y es uno de los ARNm más abundantes en las esporas latentes de B. subtilis30. La expresión de esta proteína también está regulada por un factor sigma F específico de la esporulación. Tres genes hipotéticos de pXO1 estaban regulados positivamente (log2FC de AW20_5643 = 32,20, AW20_5714 = 14,91 y AW20_5607 = 5,66). AW20_5643 (log2FC de 32.20) codifica una proteína que contiene un dominio de nucleasa y está inmediatamente aguas abajo de lef. Tres genes, todos hipotéticos, de pXO1 tuvieron una regulación negativa significativamente superior al doble: AW20_5645 (log2FC = - 7,07), AW20_5667 (log2FC = - 1,45) y AW20_5770 (log2FC = - 1,16). AW20_5667 está inmediatamente en sentido ascendente y se transcribe de manera divergente desde cya, mientras que AW20_5645 está entre lef y pagR. Los cambios en la expresión de los genes cya, lef y pag no fueron estadísticamente significativos; sin embargo, el activador transcripcional atxA (AW20_5658) experimentó una represión estadísticamente significativa de log2FC = − 0,62. Además, se identificaron reguladores transcripcionales y otros genes específicos de esporas en el momento de las 2 h. Los genes transcritos diferencialmente desde el punto de tiempo de 2 h, incluidos los genes encontrados en pXO1, se enumeran en la Tabla 3. Estos datos indican que la antrosa desempeña un papel en el paisaje transcripcional de B. anthracis en crecimiento vegetativo al servir como una molécula inductora/represora de una molécula aún no caracterizada. regulón. Se utilizó el análisis de red STRING para identificar grupos funcionales de genes en los conjuntos de datos de 30 minutos (Fig. 5F) y 2 h (Fig. 5G). Curiosamente, se identificó un grupo de genes de GMP sintetasa en el conjunto de datos de 2 h. Si la antrosa actúa como inhibidor de la GMP sintetasa (para reducir los niveles de GTP, como sugiere la evidencia), las bacterias pueden regular al alza el guaA para compensar en exceso. También se identificó un sistema de quimiotaxis de dos componentes.

Anthrose induce cambios en la expresión del antígeno protector y afecta la regulación genética global en B. anthracis Sterne. (A) La cepa indicadora luminiscente del antígeno protector (PA) de B. anthracis Sterne se cultivó con (línea púrpura) y sin (línea verde) 100 μg/ml de antrosa pura durante 48 h. (B) La cepa indicadora luminiscente del antígeno protector (PA) de B. anthracis Sterne ΔantC se cultivó en caldo BHI con (línea púrpura) y sin (línea roja) 100 μg/ml de antrosa pura durante 48 h. Las curvas de crecimiento se llevaron a cabo por triplicado con la DO a 600 nm y las unidades luminiscentes relativas (RLU) promedio y el error estándar de la media presentados en cada punto temporal. (C) Diseño experimental para medir los niveles transcriptómicos globales a los 30 min y 2 h después de agregar 10 μg/ml de antrosa pura a B. anthracis Sterne en fase logarítmica cultivada en BHI. Cada muestra se recolectó de tres experimentos y se envió a RNA-seq. (D) Expresión génica de B. anthracis Sterne 30 minutos después de la adición de 10 μg/ml de antrosa pura en comparación con el cultivo tratado simulado (agua) cultivado en paralelo y (E) después de 2 h en comparación con el cultivo tratado simulado (agua) cultivado en paralelo. Los puntos rojos indican genes significativos que experimentan un cambio mayor que 2 o menor que -2 y tienen una tasa de descubrimiento falso menor que 0,05. (F) Análisis funcional de la red de cadenas de grupos de genes de 30 minutos con etiquetas de loci BAS. El grupo rojo está relacionado con los procesos de glucocinasa, el verde azulado son procesos transmembrana de ATP y el amarillo está involucrado en el metabolismo del azúcar. Las líneas que conectan genes son evidencia diferente de interacción. (G) Análisis funcional de la red de cadenas de grupos de genes de 2 h con etiquetas de locus BAS. Los procesos biosintéticos de nucleósidos monofosfato (GMP y CTP) son parte del grupo rojo, el grupo del salmón son procesos glicolíticos, el amarillo son otros procesos metabólicos del carbono y el verde está involucrado en quimiotaxis/sistemas de dos componentes. Las líneas que conectan genes son evidencia diferente de interacción.

Nuestra observación de que la antrosa pura (en sí misma un azúcar) disminuyó la expresión de pagA y perturba globalmente los genes nos llevó a investigar si la presencia de antrosa está involucrada en la modificación de la expresión de virulencia a través del metabolismo de los carbohidratos. Con 2 mg/ml de glucosa, el caldo BHI contiene altos niveles de azúcar además de ricas fuentes de proteínas. El caldo de infusión de corazón (HIB) es esencialmente el mismo medio que el BHI sin dextrosa. Se introdujeron fusiones de promotores luminiscentes para lef y atxA en Sterne WT y el mutante Sterne ΔantC y se cultivaron en BHI, HIB y HIB + 2 mg/ml de glucosa para medir su expresión en medios ricos en proteínas y ricos en proteínas + carbohidratos (Fig. 6A– D). Lo que se puede apreciar inmediatamente en los paneles de las figuras es que las tendencias de expresión en BHI (líneas moradas) y HIB + 2 mg/ml de glucosa (líneas rojas) tienden a parecerse más entre sí que a la expresión en HIB (naranja). Los patrones de expresión de Plef en BHI (líneas moradas en las Fig. 4A y B) son similares a los observados para PpagA en las Fig. 5A y B. La expresión de PatxA en WT Sterne muestra un pico inicial prominente en un medio que contiene glucosa, luego disminuye y se variable a partir de entonces (Fig. 6A líneas moradas y rojas). En medio HIB, la expresión de WT PatxA muestra un alto nivel de inducción con RLU tres veces mayor que en BHI o HIB + glucosa (líneas naranjas de Fig. 6A). La expresión de PatxA en ΔantC Sterne cultivada en BHI y HIB + 2 mg/ml de glucosa muestra el pico inicial en la expresión y luego se aplana hasta que las bacterias entran en la fase estacionaria donde la expresión aumenta nuevamente alrededor de las 24 h (Fig. 6B, línea púrpura y roja). La expresión de PatxA en ΔantC Sterne cultivada en HIB es menor en comparación con WT Sterne, lo que indica que la producción de antrosa por bacterias en HIB puede afectar la expresión de atxA. En HIB, la expresión de Plef en WT ocurre en un pico bifásico con un máximo de 250 RLU (línea naranja de la Fig. 6C). En la Fig. 6D, la expresión de Plef en ΔantC Sterne cultivada en HIB es detectable como un pico único prominente a las 24 h con un máximo de ~ 800 RLU (línea naranja de la Fig. 6D). En ambas cepas, la adición de glucosa empujó los picos hacia la derecha, presumiblemente porque las bacterias utilizan preferentemente los azúcares. El gran aumento en la expresión de PatxA no es concomitante con la expresión de Plef, lo que indica que la antrosa puede modular la expresión de atxA a nivel transcripcional y postranscripcional. En la Fig. S5, las diferencias absolutas por pares mostraron el efecto similar de HIB + glucosa y BHI en la expresión de PatxA y Plef, lo que respalda el papel del metabolismo del carbono en el control de los regulos de toxinas.

Los patrones de expresión luminiscentes de los promotores relacionados con la virulencia de B. anthracis se ven afectados por los componentes nutricionales. Patrones de expresión luminiscentes de (A) Sterne WT PatxA-lux (B) Sterne ΔantC PatxA-lux (C) Sterne WT Plef-lux y (D) Sterne ΔantC Plef-lux, (cultivados en BHI + Km 10 (líneas moradas), HIB + Km10 (líneas naranjas), o HIB + Km10 + 2 mg/ml de glucosa (líneas rojas) muestran que el estado de la antrosa tiene diferentes efectos sobre la expresión en condiciones de nutrientes con alto contenido de proteínas y con alto contenido de azúcar.

La antrosa, como azúcar muy singular, puede desempeñar un papel en la señalización intra, inter y extracelular. Es bien conocido que B. anthracis responde fuertemente a los análogos de nucleósidos como moléculas germinantes31,32,33. Además, moléculas similares a nucleósidos pueden desencadenar la esporulación34,35. Uno de esos análogos es la decoyinina, un análogo de nucleósido producido por Streptomyces spp. Es un inhibidor de la GMP sintetasa y de Streptomyces spp. señal de esporulación y desencadena la esporulación en B. anthracis. La decoyinina inhibe la síntesis de GMP, disminuyendo así los niveles intracelulares de GTP, lo que conduce a la desrepresión de los genes del regulón represivo CodY36. Las fusiones de promotores atxA, lef y pagA en las cepas WT (Fig. 7A – D) y ΔantC Sterne (Fig. 7E – H) se cultivaron en medio HIB rico en proteínas (curvas rojas) y con antrosa (líneas naranjas) o decoyinina (líneas moradas). La adición de decoyinina disminuyó la expresión de las tres construcciones probadas en ambas cepas. La adición de la misma cantidad de antrosa disminuyó la expresión de manera similar a la decoyinina, aunque en un nivel intermedio. Las distancias por pares entre los indicadores de expresión luminiscentes muestran los efectos similares de anthrose y decoyinina en los perfiles de expresión de los promotores atxA, lef y pagA en WT y ΔantC Sterne (Fig. S6).

La antrosa y la decoyinina tienen efectos similares sobre los perfiles de expresión de genes relacionados con toxinas. Patrones de expresión luminiscentes de (A) Sterne WT Pant-lux, (B) Sterne WT PatxA-lux, (C) Sterne WT Plef-lux, (D) Sterne WT PpagA-lux, (E) Sterne ΔantC Pant-lux, ( F) Sterne ΔantC PatxA-lux, (G) Sterne ΔantC Plef-lux y (H) Sterne ΔantC PpagA-lux cultivados en HIB + Km 10 (líneas rojas), HIB + Km10 + anthrose pura (líneas naranjas), o HIB + Km10 + decoyinina (líneas moradas) muestran que la antrosa exógena tiene impactos similares en la expresión genética que la decoyinina en condiciones altas en proteínas y bajas en azúcar; y principalmente durante la fase estacionaria.

Para ver si la expresión del operón de la antrosa y los genes de la toxina se pueden modular mediante niveles nativamente relevantes de antrosa externa, se mezclaron cepas WT Sterne y ΔantC Sterne que contenían los vectores de expresión vacíos en proporciones 50:50 con las cepas de fusión luminiscentes relevantes y se cultivaron en BHI. caldo (Fig. 8A – H) o caldo HIB (Fig. 8J – R). De acuerdo con los estudios en los que se añadió antrosa exógena pura a cultivos cultivados en caldo BHI, el cocultivo con cepas de vectores vacíos positivos para antrosa condujo a una mayor expresión de las fusiones de promotores luminiscentes en los fondos WT y ΔantC Sterne (líneas azules), en comparación a cocultivos con las cepas de vector vacío ΔantC Sterne (líneas rojas). Curiosamente, el cocultivo con la cepa de vector vacío ΔantC redujo la expresión del promotor de antrosa (Fig. 8A, E, J y N; líneas rojas en comparación con azul) independientemente del estado del medio o de la antrosa. La expresión fue consistentemente menor en los promotores lef y pagA cuando se cultivaron conjuntamente con la cepa de vector vacío ΔantC independientemente del estado del medio o de la antrosa de la cepa informadora. En BHI, cuando las fusiones de atxA se cultivan en la cepa afín de antrosa de vector vacío (similar versus similar), se expresan a partir de P-atxA como si se cultivaran en cultivos individuales de BHI (Fig. 8B y F). Cuando cualquiera de las fusiones de P-atxA se cultiva en HIB con el mutante ΔantC, la expresión de P-atxA es similar a la de los monocultivos (Fig. 8K y O). Como se esperaba, las cepas de vectores vacíos por sí solas no generaron ninguna señal luminiscente (Fig. 8I, R).

El cocultivo con cepas positivas a antrosa afecta la expresión de genes biosintéticos de antrosa relacionados con la virulencia. Patrones de expresión luminiscentes de (A) Sterne WT Pant-lux, (B) Sterne WT PatxA-lux, (C) Sterne WT Plef-lux, (D) Sterne WT PpagA-lux, (E) Sterne ΔantC Pant-lux, ( F) Sterne ΔantC PatxA-lux, (G) Sterne ΔantC Plef-lux, (H) Sterne ΔantC PpagA-lux cuando se cultiva en BHI en una mezcla 50:50 con la cepa Sterne WT EV (líneas azules en cada gráfico) o Sterne ΔantC Deformación EV (líneas rojas en cada gráfico). (I) Muestra que los cultivos puros de la cepa Sterne WT EV o de la cepa Sterne ΔantC EV no son luminiscentes. (J – R) son las mismas cepas de cocultivo que (A – I), pero se cultivaron en HIB.

Nuestros hallazgos identificaron numerosos aislamientos de hormiga B. anthracis además de las cepas WAG descritas anteriormente. Lo que planteamos inicialmente como un genotipo limitado a África occidental abarca aislamientos de todo el mundo, incluidas cepas exportadas y aquellas involucradas en eventos de enfermedades humanas. Estas cepas de hormigas han estado causando infecciones en animales en los EE. UU. desde al menos 1960 (aislado de ovejas 2002013072). El acertadamente llamado clado de la heroína y el clado emergente 'djembe' son dos grupos de hormigas importantes asociados con eventos peligrosos de exportación de ántrax de alto perfil que resultan en casos humanos. La presencia de cepas de hormigas en el clado Ames (Han y FDAARGOS_694), América del Sur y WAG expande en gran medida las cepas de hormigas observadas a muchos de los principales clados A. También hemos demostrado mediante el análisis de la siesta de exosporio, que la ausencia de antrosa en el exosporio da como resultado una menor densidad de la siesta y un peso molecular reducido de la proteína principal del exosporio, BclA. La eliminación de antrosa cambió el perfil de unión de la vacuna AVA humana, lo que indica una reducción en la unión de los anticuerpos específicos de la vacuna a BclA glicosilada de alto peso molecular. Esto nos llevó a investigar la presencia de respuestas de anticuerpos específicas de esporas en el suero inmune. Se encontraron anticuerpos contra material no proteico específico de esporas en suero policlonal de conejo contra esporas vivas, suero de bisonte vacunado con Sterne y, sorprendentemente, sueros humanos combinados vacunados con AVA. La vacuna AVA está hecha de filtrado de células vegetativas adsorbidas en alumbre y nuestros datos indican que hay componentes presentes que estimulan las respuestas inmunes a los componentes proteicos y no proteicos de la espora de B. anthracis. Hemos demostrado que la adición de antrosa exógena causa cambios transcripcionales en bacterias vegetativas tan pronto como 30 minutos después de la exposición, vinculando una molécula específica de espora con impactos en la fisiología de las células vegetativas. Dos horas después de la exposición, las proteínas específicas de la esporulación están reguladas positivamente. Por ejemplo, yfhD está regulado positivamente en la espora en respuesta a la exposición al etanol o la privación de glucosa en Bacillus subtilis 37. También es la ubicación prevista de un ncRNA en su extremo 3'38. Este gen experimentó un aumento de más de 100 veces en la expresión 2 h después de la adición de antrosa pura. En B. subtilis, la expresión de yfhD está regulada por sigma-F, cuya actividad se deprime durante la septación asimétrica de la forespora 39. Varias proteínas hipotéticas en pXO1 experimentan niveles significativos de expresión diferencial. Estos cambios transcripcionales podrían proporcionar la fuerza impulsora para la mutación del operón antrosa en las células vegetativas. La recopilación de datos presentada aquí proporciona más información sobre las consecuencias de la mutación de la antrosa.

Hemos demostrado que la antrosa y la decoyinina pueden actuar a través de vías similares para controlar la expresión de toxinas. Los experimentos demostraron que la eliminación de anthrose desplazó la inducción de su propio promotor a estacionario temprano en comparación con estacionario tardío en el WT. La adición de antrosa exógena o decoyinina reprimió la expresión de Pant en la cepa WT y tuvo poco efecto sobre ΔantC; quizás debido a la continua incapacidad de producir antros. Cuando se añadió antrosa a cultivos que contenían caldo BHI, que contiene altos niveles de glucosa, aumentó la expresión de la fusión del promotor pagA. Esto podría explicarse por el control postranscripcional de atxA por parte del sistema de azúcar PTS y su vínculo con la disponibilidad de nutrientes dependiente de la fase de crecimiento. CodY se une a aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) y GTP, mejorando su afinidad por sus objetivos40. Cuando los BCAA y/o GTP se vuelven limitantes, como durante las condiciones de esporulación en medios menos complejos o el tratamiento con antrosa o decoyinina en HIB, CodY es incapaz de unirse a las regiones promotoras de los genes que regula, lo que lleva a su desrepresión; esto podría incluir la desrepresión de la proteasa hasta ahora no identificada que, según se ha planteado la hipótesis, controla postraduccionalmente los niveles de AtxA. En resumen, el efecto posterior del tratamiento con antrosa en medios ricos (BHI) es una mayor expresión de atxA y mayores niveles de expresión de toxina debido al predominio de los mecanismos de regulación de toxinas independientes de CodY durante el crecimiento logarítmico; como la regulación de la expresión de atxA por AbrB41. En fases posteriores de crecimiento, domina la regulación de la toxina dependiente de CodY y la presencia de antrosa se coordina con atxA menos activo y menor expresión de toxina. AbrB es un represor de atxA y la expresión de toxinas. AbrB normalmente es inhibido por Spo0A fosforilada (Spo0A ~ P) durante condiciones de crecimiento logarítmico que permiten la expresión de atxA y toxina42. Nuestros datos muestran que durante el crecimiento logarítmico la expresión de atxA y la expresión de la toxina están muy reprimidas en el mutante de antrosa en comparación con el Sterne de tipo salvaje. Sin embargo, los niveles de expresión de atxA no se coordinaron con la expresión de la toxina. Los niveles bajos de expresión de atxA en el mutante antrosa suprimen el pico inicial de expresión de la toxina que se encuentra en el tipo salvaje. El segundo pico en la expresión de la toxina se amplifica en el mutante antrosa. En ese sentido, la adición de antrosa exógena reprime ese segundo pico de expresión de toxinas tanto en Sterne con antros positivo como en antros negativo, lo que respalda aún más el papel de la antrosa en la regulación de la expresión de toxinas en la transición al crecimiento estacionario y más allá. Los experimentos de cocultivo mostraron que el estado de antros de B. anthracis, el estado de nutrientes de B. anthracis con el que crecen y los nutrientes en los que crecen pueden causar cambios diferentes en la expresión de importantes genes de virulencia. Estos patrones deben investigarse más a fondo para evaluar la jerarquía de señalización a través de grupos de antrosa extracelulares e intracelulares y cómo afectan la expresión de virulencia in vivo.

Hemos generado un modelo plausible para ayudar a resumir nuestros hallazgos en el contexto de nuestros datos publicados anteriormente sobre ántrax subcutáneo y esporas negativas de antrosa (Fig. 9). La Figura 9 muestra cómo, en el curso de la infección subcutánea, las esporas de ántrax positivas a antros germinan y secretan toxina para permitir que las infecciones locales se propaguen sistémicamente de acuerdo con la hipótesis de diseminación de la fuga de la cárcel (Fig. 9A). Por el contrario, las esporas negativas de antros no germinan tan rápido e interactúan más eficientemente con los fagocitos profesionales en el sitio de inoculación, lo que permite la diseminación asistida por fagocitos a tejidos secundarios como se describe en el modelo del caballo de Troya de diseminación del ántrax. Los niveles más bajos de secreción de toxinas por las esporas negativas de la antrosa permiten una mayor interacción entre las bacterias y los fagocitos; se produce un gran aumento en la secreción de toxinas cuando las fuentes de proteínas se vuelven limitadas, lo que resulta en una mayor diseminación y un tiempo medio de muerte más corto en ratones y G. mellonella, como se publicó anteriormente. Este modelo ayuda a unificar los hallazgos in vitro e in vivo que rodean a B. anthracis negativo a antrosa. En nuestro trabajo anterior, encontramos una reducción similar en LD50 cuando los ratones fueron desafiados con el mutante negativo de antrosa por vía intranasal18. Al extrapolar datos publicados anteriormente que muestran una mayor interacción de las esporas negativas de antros con macrófagos y una mayor unión al receptor CD14 de macrófagos, se podría favorecer el modelo de caballo de Troya de diseminación mediada por células huésped. Las esporas negativas de antros podrían eliminarse del espacio broncoalveolar más rápido que las esporas positivas de antros debido a la mayor interacción con los fagocitos. La infección por ántrax es un espectro de diseminación donde la patología está mediada por la supervivencia bacteriana y la secreción de toxinas in vivo. En este trabajo, nos centramos en la acapsular B. anthracis Sterne y el papel de la antrosa en la expresión de toxinas. Nuestro trabajo futuro se centrará en probar este modelo mediante mediciones in vivo de la secreción de toxinas, la propagación de patógenos y la participación celular y sus impactos en la patogénesis de B. anthracis encapsulado completamente patógeno. La cápsula es un factor de virulencia importante cuya regulación e inducción puede controlarse mediante la expresión de atxA43,44 y tanto la expresión de atxA como la de la cápsula están vinculadas a los niveles de CO245. Observamos los efectos de la antrosa, tanto externa como interna, sobre la expresión de atxA y al mismo tiempo mostramos que es probable que haya otros reguladores involucrados. Como hemos analizado el papel de la antrosa en la expresión de toxinas como parte de este trabajo, el siguiente paso lógico es comprender si la expresión de la cápsula en B. anthracis se ve afectada y si la virulencia en los animales puede verse afectada.

Modelo de estado de antros y diseminación en ántrax subcutáneo. (A) Las esporas positivas de anthrose germinan más rápido y elaboran más toxina durante el crecimiento vegetativo. Los fagocitos profesionales en el sitio de la infección son destruidos por los altos niveles de toxinas. En el modelo de ántrax subcutáneo, la diseminación a tejidos secundarios ocurre principalmente después de la infección en los sitios de inoculación locales y luego a través de los vasos linfáticos dañados; como se sugiere en la hipótesis de la fuga de la cárcel. (B) Las esporas negativas de antrosa germinan a un ritmo más lento y secretan niveles más bajos de toxina cuando germinan. Los fagocitos sobreviven a los niveles reducidos de toxina, interactúan a mayor velocidad y fagocitan las esporas negativas de la antrosa con más frecuencia que las esporas positivas de la antrosa. Las esporas y las células vegetativas se fagocitan, sobreviven intracelularmente y son transportadas a tejidos secundarios, lo que conduce a niveles más altos de diseminación tisular; como en el modelo del caballo de Troya. Los niveles más altos de diseminación coinciden con picos en los niveles de secreción de toxinas que acompañan a la reducción del tiempo medio hasta la muerte observado en las infecciones por esporas negativas de ántrosa. Creado con BioRender.com.

La detección de antrosa exógena (en trans) también tiene implicaciones en la ecología de patógenos. La antrosa exógena, ya sea adherida a la superficie de una espora o flotando libremente, podría proporcionar señales que empujen a las células vegetativas hacia la esporulación, proporcionando así un medio de comunicación entre esporas y células vegetativas de las condiciones que inducen la esporulación. Se encuentran residuos de azúcar con estructuras muy similares a la antrosa en cápsulas producidas en ciertos estados de crecimiento por Shewanella spp. cepa MR-4 y como glicosilaciones del flagelo de Pseudomonas syringae46. Shewanella spp. se encuentran en ambientes anaeróbicos de suelo y agua, mientras que P. syringae es un patógeno vegetal ubicuo. El suelo y los entornos vegetales son lugares donde B. anthracis interactuaría con estas dos bacterias en condiciones ambientales adversas. Sería interesante evaluar si los residuos de antrosa en estos gramnegativos no relacionados son suficientes para inducir cambios en la expresión génica en B. anthracis que observamos aquí; proporcionando otro medio para que B. anthracis detecte condiciones de crecimiento desfavorables.

Se aisló ADNg de 1 ml de cultivos de B. anthracis cultivados en caldo BHI durante la noche utilizando el kit microbiano Dneasy UltraClean (Qiagen: Germantown, MD, EE. UU.). El ADN se esterilizó por filtración utilizando filtros centrífugos Corning Costar Spin-X de 0,22 mm. Se inoculó una décima parte del volumen de muestra en 3 ml de caldo BHI con agitación. Después de 48 h, se esparcieron 100 ml de la muestra en placa sobre agar BHI para verificar la esterilidad de la muestra. Se retiraron muestras estériles de la contención alta y el ADN se fragmentó y preparó para la secuenciación utilizando el kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext Ultra II FS (New England Biolabs: Ipswich, MA, EE. UU.) según lo recomendado por el fabricante. Las muestras se multiplexaron utilizando NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (New England Biolabs; Ipswich, MA, EE. UU.). Se utilizó el kit de reactivos MiSeq v3 de 600 ciclos para secuenciar muestras multiplexadas en el MiSeq ubicado en el Instituto de Patógenos Emergentes de la Universidad de Florida, Gainesville.

Blastn se utilizó para la identificación inicial de mutaciones del operón antrosa. Se utilizó la infraestructura informática de investigación de alto rendimiento HiPerGator de la Universidad de Florida para analizar archivos de secuenciación de próxima generación. Los archivos Fastq se descargaron del Sequence Read Archive (SRA) de acceso público en el NCBI o del EMBL European Nucleotide Archive o de nuestras propias ejecuciones de Illumina MiSeq. Las lecturas sin procesar se asignaron al ancestro Ames de B. anthracis usando BWA-MEM47 y se visualizaron usando IGV48 para verificar las mutaciones de antrosa. El ensamblaje de novo de genomas se logró recortando archivos fastq para obtener calidad usando Trimmomatic49, ensamblados con SPAdes50 y pulidos con Pilon51. La calidad del ensamblaje del genoma se verificó utilizando Quast52. El análisis de SNP del genoma completo se realizó utilizando el paquete PhaME53 ejecutado en HiPerGator y los árboles se construyeron utilizando la opción RaxML dentro de PhaME54. Los árboles filogenéticos se visualizaron utilizando iTOL55.

Se utilizó Escherichia coli DH5α como cepa de clonación y se cultivó en caldo LB o agar a 37 °C. La cepa movilizable RHO3 se cultivó en presencia de 200 μg/ml de DAP (Millipore Sigma: Burlington, MA, EE. UU.) para conjugar plásmidos en B. anthracis de tipo salvaje, como se describió anteriormente56,57. La contraselección se logró omitiendo DAP del medio selectivo. Se utilizó kanamicina a 35 µg/ml en cepas de E. coli y 10 µg/ml en cepas de B. anthracis. B. anthracis Sterne 34F2 se obtuvo de Colorado Serum Company (EE. UU.) y se cultivó con caldo o agar BHI (Becton Dickinson: Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) o caldo de infusión de corazón (HIB); (Research Products International: Mount Prospect, IL, EE. UU.) a 37 °C. La antrosa pura se adquirió de Millipore Sigma (Burlington, MA, EE. UU.) y la decoyinina se obtuvo de Abcam (Waltham, MA, EE. UU.). El mutante ΔantC de B. anthracis Sterne 34F2 y el complemento se crearon como se describió anteriormente18. B. anthracis de tipo salvaje proviene de la colección Martin E. Hugh-Jones Bacillus anthracis ubicada en el Instituto de Patógenos Emergentes de la Universidad de Florida. Las bacterias se manipularon utilizando prácticas y procedimientos BSL3 según BMBL en una instalación registrada e inspeccionada por CDC/USDA.

Las esporas se prepararon como se describió brevemente18. Las cepas de B. anthracis se cultivaron durante la noche en caldo BHI, se esparcieron en placas de agar con medio de esporulación Difco (DSM) y se incubaron a 30 °C durante 5 días. Las esporas se recogieron en agua fría estéril y se purificaron mediante gradientes de ácido diatrizoico. Los sedimentos se resuspendieron en etanol al 85% durante 1 h para matar cualquier resto de células vegetativas y luego se lavaron en agua fría antes del recuento y almacenamiento a 4 °C.

La sustitución por congelación y la microscopía electrónica se realizaron como se describió anteriormente con modificaciones menores58. Las esporas se suspendieron en fijador de Trump (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) durante 24 h y se almacenaron a 4 °C y luego se sedimentaron a 10.000 rpm durante 5 min (Fisher Scientific Micro -Centrífuga Modelo 59A). Luego, las células se lavaron en cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,24 utilizando un microondas de laboratorio Pelco BioWave Pro (Ted, Pella, Redding CA, EE. UU.). Las esporas se colocaron en un portamuestras de aluminio tipo A HPM100 de 3 mm y 200 μm de profundidad (Leica Microsystems, Viena, Austria), precargado con crioprotector de 1-hexadeceno. Los portamuestras que contenían esporas se cubrieron con otro portamuestras de aluminio tipo A y se congelaron a alta presión usando HPM 100 (Leica Microsystems, Viena, Austria). Las muestras congeladas se transfirieron a crioviales preenfriados en nitrógeno líquido y luego se llenaron con tetróxido de osmio al 2% (p/v) y acetato de uranilo al 0,1% en acetona anhidra. La sustitución por congelación se llevó a cabo en una unidad de sustitución por congelación (AFS2, Leica Microsystems, Viena, Austria) a -90 °C durante 72 h, la temperatura se redujo con dos pasos adicionales de sustitución por congelación a -50 °C durante 24 h y - 10 ºC durante 24 h. Después de la sustitución por congelación, las muestras congeladas se retiraron de los portamuestras, se lavaron en acetona anhidra y la temperatura se elevó a 4 °C. Las etapas de infiltración de resina se llevaron a cabo en un microondas de laboratorio como se describió anteriormente. Las muestras deshidratadas se infiltraron en resina epoxi graduada con acetona-Embed/Araldite con imprimación de inclusión Z6040 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) al 30 %, 50 %, 70 % y 100 % y luego se curaron a 70 °C. Se recogieron secciones ultrafinas (aproximadamente 120 nm) en rejillas de cobre recubiertas de carbono/Formvar de malla 100 y se contratiñeron con acetato de uranilo acuoso al 2 % y citrato de plomo de Reynold. Las secciones se examinaron con un TEM FEI Tecnai G2 Spirit Twin (FEI Corp., Hillsboro, OR) operado a 120 kV y las imágenes digitales se adquirieron con una cámara Gatan UltraScan 2 k × 2 k y el software Digital Micrograph (Gatan Inc., Pleasanton, CA) en el núcleo de microscopía electrónica del Centro Interdisciplinario de Investigación Biotecnológica de la Universidad de Florida.

Las micrografías electrónicas se analizaron utilizando Fiji59. La siesta de exosporio de 10 imágenes de cada cepa se linealizó utilizando una selección de línea de 50 píxeles y la función de enderezamiento en Fiji. Se crearon mapas de calor de gráficos de superficie 3D alineando la siesta de 10 esporas seleccionadas al azar utilizando la función de trazado de superficie 3D. Se crearon histogramas de las imágenes enderezadas y se determinó la densidad de píxeles.

Se recogieron muestras para transferencias Western y se hirvieron en tampón de muestra SDS-PAGE estándar durante 10 minutos. Las muestras se procesaron en geles prefabricados de poliacrilamida SDS al 4-15 % (BioRad: Hercules, CA, EE. UU.) durante 1 h a 120 V. Las muestras se electrotransfirieron a membranas Immobilon PSQ PVDF empapadas en metanol (Millipore-Sigma: Burlington, MA). , EE. UU.) utilizando una transferencia semiseca a 17 V durante 20 min. Las transferencias se bloquearon con leche desnatada al 5% en 1xPBS + Tween 20 al 0,05% (PBST) durante 1 h antes del lavado 5 veces en PBST durante 3 minutos cada uno. Los anticuerpos primarios se agregaron a 1:1000 en una solución de bloqueo con balanceo suave durante 1 h. Después de otras cinco rondas de lavado con PBST, se agregaron anticuerpos de detección a 1:1000 para transferencias colorimétricas o 1:20,000 para transferencias quimioluminiscentes en solución de bloqueo durante 1 h y luego se lavaron nuevamente como antes. Para las transferencias colorimétricas, se utilizó como sustrato la solución de transferencia 1-Step Ultra TMB (ThermoFisher Scientific: Waltham, MA, EE. UU.), mientras que SuperSignal West Pico PLUS (ThermoFisher Scientific: Waltham, MA, EE. UU.) fue el sustrato para las transferencias quimioluminiscentes. Ambos sustratos se utilizaron según las recomendaciones del fabricante. Se tomaron imágenes de las transferencias en un sistema de documentación de gel BioRad Gel Doc XR + (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA, EE. UU.) en modo quimioluminiscente con exposición manual de 60 s. El anticuerpo policlonal anti-PA de cabra y la PA recombinante se obtuvieron de List Labs. El anticuerpo policlonal de conejo anti-BclA (NR-9578) se obtuvo de recursos de BEI. Los anticuerpos monoclonales de ratón LF-3H3 y LF-9A11 contra LF (NR-12187 y NR-12188) y P2E3H4 contra EF (NR-15473) se obtuvieron de BEI Resources. Los anticuerpos de detección secundaria conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) utilizados fueron los siguientes; IgG HRP de cabra anti-ratón (Invitrogen A16072), IgG HRP de cabra anti-humano (Invitrogen 31,412), IgG HRP de conejo anti-cabra (Sigma A8919) y IgG HRP de cabra anti-conejo (Sigma A0545). El antígeno protector se midió mediante ELISA con el ELISA cuantitativo de proteína del antígeno protector 83 (PA83) del ántrax (Alpha Diagnostics International; San Antonio, TX, EE. UU.; 800–100-P83) realizado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

La cepa 34F2 de B. anthracis Sterne se cultivó durante la noche en caldo BHI a 37 °C y se estandarizó a una DO600 de 0,5 y se dividió en 6 tubos: por triplicado para antrosa pura (Sigma) como tratamiento a una concentración final de 10 μg/ml, y por triplicado. para un simulacro de agua agregada. Las muestras se recogieron por triplicado a los 30 min y por triplicado a los 120 min después de la introducción de cualquiera de los líquidos. Las muestras en cada momento se procesaron inmediatamente a través del kit Zymo Direct-zol RNA Miniprep Plus (Zymo Resrearch; Irvine, CA, EE. UU.), que incluye los pasos opcionales de batido de perlas, así como el tratamiento con ADNasa en columna. El ARN resultante se cuantificó en un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EE. UU.) y se guardó a –80 °C. Para eliminar los ARNr contaminantes, se trataron ~ 1,6 μg de cada muestra con la exonucleasa dependiente de fosfato 5′ Terminator™ (Lucigen; Middleton, WI, EE. UU.) y se limpiaron con el kit de limpieza de transcripción Ambion MEGAclear (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EE. UU.) mientras se eliminan los ARNt y los ARNs. Después de una verificación de la degradación del ARNr mediante un gel desnaturalizante de ARN blanqueador, se estandarizó una cantidad de 60 muestras mediante NanoDrop 2000.

Las bibliotecas de RNAseq se prepararon utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext® Ultra™ II para Illumina® siguiendo las recomendaciones del fabricante. Luego se analizó el tamaño correcto de las bibliotecas de muestras resultantes mediante un chip de análisis de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer 2100 (Agilent; Santa Clara, CA, EE. UU.). Las bibliotecas se secuenciaron utilizando un Illumina NovaSeq 6000. Los archivos fastq resultantes se enviaron a la tubería de análisis PATRIC RNA Seq61,62 utilizando la suite Tuxedo63 para analizar las transcripciones entre réplicas y la importancia entre tratamientos. Se visualizaron genes importantes utilizando GraphPad Prism. Los datos sin procesar y procesados ​​del experimento se han depositado en Gene Expression Omnibus y se puede acceder a ellos a través del número de acceso de la Serie GEO GSE220794 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE220794). Se utilizó el análisis de redes de cadenas para identificar grupos de regulación genética en estos conjuntos de datos64. Las líneas que conectan genes son evidencia diferente de interacciones de la base de datos STING que extrae varios recursos bioinformáticos.

El plásmido pRepU-kan-AmCyan se creó mediante PCR amplificando el esqueleto con oligos fosforilados RepUKanCFPFOR (5′-Phos/tttcattggatccccccgggagatc-3') y RepUKanCFPREV (5′-Phos/agtgagtcgacctcgacaaaaga-3'). El producto de la PCR se digirió con DpnI para eliminar el molde del plásmido y luego se autoligó. El plásmido resultante se verificó mediante BamHI/KpnI. El plásmido pRepU-kan-AmCyan-antABCDSterne se creó digiriendo pRP1099 65 con BamHI y SalI y amplificando el operón antABCD de B. anthracis Sterne mediante PCR con ADN polimerasa Q5 y ​​oligos AntAssemF2 (5′-acttcgttcttttgtcgaggCTTGTATTGTCCACTTATTTTATCCC-3') y AntAssemR. 2 (5 ′-gatatcgagatctcccggggACATAATATCCCCTCATACACAC-3′). Se utilizó el kit de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi para ensamblar la columna vertebral del plásmido y el operón de antrosa mediante el ensamblaje de Gibson de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La inserción correcta se verificó mediante doble digestión del inserto con EcoRI y HindIII.

El plásmido pRepU-kan-AmCyan se creó como se indicó anteriormente. pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux se produjo como se describió anteriormente66. El operón luxABCDE optimizado y reordenado con codones grampositivos de pMV306-hsp-lux se obtuvo de Addgene y se creó como se describe en 67. El promotor lef se amplificó con Plef-Up_NotI (5′-TAT GCG GCC GCG CAA AAA ACA AAC TAA AT-3') y Plef-Dn_EcoRI (5′-ATG AAT TCT CTC CTT TTT TAT AA GTG-3') y luego se digirió. con EcoRI y NotI luego se insertaron en pMV306-PpagA-lux66 digerido con las mismas enzimas para crear pTs-repA-kan-Plef-lux. pRP1099 se digirió con BamHI y SalI y se combinó con el fragmento Plef-lux amplificado con NEBuildLEFLUXFWD (5′-TCT CGA CTT CGT TCT TTT GTC GAG GGC AAC GCG TGC G-3') y NEBuildLEFLUXREV (5′-AAT TCG ATA TCG AGA TCT CCC GGG GTG ATC ACC GCG GCC ATG AT-3′) luego se ensambló usando el kit de ensamblaje NEBuilder HiFi. La digestión con EcoRI y NotI confirmó una banda de 250 pb que coincide con el promotor lef y la secuencia verificada mediante secuenciación de Sanger con el oligo de secuenciación lux-seq (5′-CAA ACT CCG TGA AAT GAT GCT CC-3'). Para crear oligos pRepU-kan-AmCyan-PsigF-lux PspoIIAAsigF.FOR ​​(5′-TCT CGA CTT CGT CGG CAA ATA TTT TGC CGC TTT TCT AT-3′) y PspoIIAAsigF.REV (5′-TTC CAA ATT TCA TAC GAT TTC CTC CTT ATG CTC AAA CTT TAC TAA TT-3') amplificó el promotor spoIIAA-spoIIAB-sigF y se ensambló con el fragmento pRepU-kan-AmCyan-lux amplificado a partir de pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux con oligos LuxPspoAAIIsigF. FOR (5′-GGA GGA AAT CGT ATG AAA TTT GGA AAC TTT TTG CTT ACA TAC CAA CCT CCC C-3′) y RepuKmPspoAA.REV (5′-AAA ATA TTT GCC GAC GAA GTC GAG ATC AGG GAA TGA GTT-3 ′). Para crear oligos pRepU-kan-AmCyan-Pant-lux Pant.FOR (5′-TCT CGA CTT CGT CCG AAG GAA TGT AAA GAT GAT TAA TAT GGT AGT AGA ATA ATT TAA AG-3′) y Pant.REV (5′ -TTC CAA ATT TCA TAA AAA GTC CCC TTT TAA ATC CCT AAT TTT TCT-3') amplificó el promotor antABCDE y se ensambló con el fragmento pRepU-kan-AmCyan-lux amplificado a partir de pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux con oligos LuxPant.FOR (5′-AGG GGA CTT TTT ATG AAA TTT GGA AAC TTT TTG CTT ACA TAC CAA CCT CCC-3′) y RepUPant.REV (5′-TAC ATT CCT TCG GAC GAA GTC GAG ATC AGG GAA TG-3 ′). Para crear los oligos pRepU-kan-AmCyan-PatxA-lux PatxA.FOR (5′-TCT CGA CTT CGT GTT CTA AAT CGT AAG GGG TTT TAT TAG TTA TAT TTC TTT TTT AGT TCA-3′) y PatxA.REV (5′ -TTC CAA ATT TCA TGT CTA TAA TTG ATT CTC CTT TCC TGT TGT G-3′) amplificó el promotor atxA y se ensambló con el fragmento pRepU-kan-AmCyan-lux amplificado a partir de pRepU-kan-AmCyan-PpagA-lux con oligos LuxPatxA.FOR (5′-TCA ATT ATA GAC ATG AAA TTT GGA AAC TTT TTG CTT ACA TAC CAA C-3′) pRepUKmPatxA.REV (5′-TAC GAT TTA GAA CAC GAA GTC GAG ATC AGG GAA TG-3′) . La presencia de cada promotor se confirmó por PCR y luego la secuenciación de Sanger de cada plásmido con oligo lux-seq (5′-CAA ACT CCG TGA AAT GAT GCT CC-3') confirmó la secuencia esperada.

Para las curvas de crecimiento luminiscentes, las bacterias se cultivaron en cultivos iniciadores de HIB durante la noche con 10 µg/ml de kanamicina cuando fue necesario. La DO600 se midió diluyendo 1:10 en medio nuevo y calculando nuevamente mediante el factor de dilución. Los cultivos se normalizaron a una DO600 de 1 en medio nuevo específico del ensayo que contenía 10 µg/ml de kanamicina. Se utilizaron cultivos normalizados para inocular los diferentes medios con diluciones 1:40. Se cultivaron alícuotas de 150 µl en placas de fondo óptico repelentes de células negras de 96 pocillos (Greiner Bio-One; Monroe, NC, EE. UU.). Los ensayos se realizaron en un lector de placas Synergy Mx (BioTek; Winooski, VT, EE. UU.) a 37 °C con agitación orbital a 425 cpm. La densidad óptica a 600 nm (OD600) y las unidades luminiscentes relativas (RLU) se registraron cada 10 minutos durante 48 h. Cada ensayo se realizó por triplicado biológico y por duplicado técnico. Se obtuvieron imágenes de la luminiscencia de la placa colocando 20 µl de cultivos diluidos 1:40 en placas de agar HIB + Km10 y visualizando después de 24 h de crecimiento a 37 °C como se indicó anteriormente para las transferencias Western quimioluminiscentes.

Los experimentos de cocultivo se realizaron cultivando cultivos iniciadores como se describe anteriormente y luego mezclando el vector vacío no luminiscente que contiene B. anthracis Sterne 34F2/pRepU-kan-AmCyan o el no luminiscente B. anthracis Sterne 34F2 ΔantC/pRepU-kan- Cepas AmCyan con las cepas indicadoras luminiscentes indicadas en una proporción de 50:50 o solas en BHI + Km10 o HIB + Km10. Las señales luminiscentes se midieron como se describe en los otros ensayos luminiscentes de este trabajo.

La diferencia entre dos series temporales se puede resumir como el conjunto de diferencias entre los valores de la primera y segunda serie para cada punto temporal (que puede ser positivo o negativo dependiendo de qué valor de la serie es mayor) o como el conjunto de valores absolutos. diferencias para cada punto temporal (que sólo pueden ser no negativas). El número de elementos en dichos conjuntos corresponde al número de momentos comparados entre las dos series consideradas.

Las diferencias absolutas por pares para cada punto temporal se resumieron visualmente para ver cómo esas diferencias cambiaban con el tiempo (Fig. S5). Además de eso, las diferencias también se presentaron como histogramas, que ilustran si una serie tiende a ser más grande que la otra y con qué frecuencia. En la Fig. S6 se presentaron las diferencias por pares con el signo correspondiente para cada punto de tiempo, donde los valores superiores a cero indican que la primera serie comparada es mayor que la segunda y los valores negativos indican lo contrario.

Todos los datos de este trabajo están disponibles en el manuscrito, su suplemento o en línea. Los datos sin procesar y procesados ​​del experimento RNA-seq se han depositado en Gene Expression Omnibus y se puede acceder a ellos a través del número de acceso de la Serie GEO GSE220794 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ?acc=GSE220794).

Turnbull, PCB Introducción: Historia, enfermedad y ecología del ántrax. Ántrax 271, 1-19 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

Bozue, JA, Welkos, S. & Cote, CK El Bacillus anthracis Exosporium: ¿Cuál es el gran problema "peludo"? Microbiol. Espectro. 3, 3515 (2015).

Artículo de Google Scholar

Boone, TJ y cols. Ensamblaje coordinado de la capa de Bacillus anthracis y el exosporio durante la formación de la capa externa de esporas bacterianas. mBio 9, 501166–18 (2018).

Artículo de Google Scholar

Sylvestre, P., Couture-Tosi, E. & Mock, M. Una glicoproteína de superficie similar al colágeno es un componente estructural del exosporium de Bacillus anthracis. Mol. Microbiol. 45, 169-178 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Giorno, R. y col. Localización y ensamblaje de proteínas que comprenden las estructuras externas de la espora de Bacillus anthracis. Microbiología 155, 1133-1145 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Friedlander, AM Abordar el ántrax. Naturaleza 414, 160-161 (2001).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Redmond, C., Baillie, LWJ, Hibbs, S., Moir, AJG & Moir, A. Identificación de proteínas en el exosporio de Bacillus anthracis. Microbiología 150, 355–363 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Patricia, S., Evelyne, C.-T. & Michèle, M. El polimorfismo en la región similar al colágeno de la proteína BclA de Bacillus anthracis conduce a una variación en la longitud del filamento de exosporio. J. Bacteriol. 185, 1555-1563 (2003).

Artículo de Google Scholar

Daubenspeck, JM y cols. Nuevas cadenas laterales de oligosacáridos de la región similar al colágeno de BclA, la glicoproteína principal del exosporium de Bacillus anthracis. J. Biol. Química. 279, 30945–30953 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dong, S. y col. Caracterización de las enzimas codificadas por el operón biosintético de antrosa de Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 192, 5053–5062 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, S. y col. Operón biosintético antrosa de Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 190, 2350–2359 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Z. y col. Un operón de cuatro genes en Bacillus cereus produce dos azúcares raros que decoran las esporas. J. Biol. Química. 292, 7636–7650 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maes, E. y col. La glicosilación de la glicoproteína BclA de Bacillus cereus y Bacillus anthracis exosporium es de dominio específico. J. Biol. Química. 291, 9666–9677 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bozue, J., Cote, CK, Moody, KL & Welkos, SL Bacillus anthracis completamente virulento no requiere la proteína inmunodominante BclA para su patogénesis. Infectar. Inmune. 75, 508–511 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brahmbhatt, TN y cols. La proteína BclA de Bacillus anthracis exosporium afecta la germinación de las esporas, la interacción con las proteínas de la matriz extracelular y la hidrofobicidad. Infectar. Inmune. 75, 5233–5239 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bozué, J. et al. Las esporas de Bacillus anthracis del mutante bclA exhiben una mayor adherencia a las células epiteliales, fibroblastos y células endoteliales, pero no a los macrófagos. Infectar. Inmune. 75, 4498–4505 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oliva, C., Turnbough, CL Jr. & Kearney, JF Interacciones CD14-Mac-1 en la internalización de esporas de Bacillus anthracis por macrófagos. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 106, 13957–13962 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Norris, MH y cols. Evolución convergente de diversas cepas de brotes de Bacillus anthracis hacia oligosacáridos de superficie alterados que modulan la patogénesis del ántrax. PLoS Biol. 18, e3001052 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tamborrini, M. et al. Identificación de un linaje africano de Bacillus anthracis que carece de expresión del oligosacárido que contiene antrosa asociado a la superficie de las esporas. J. Bacteriol. 193, 3506–3511 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blackburn, JK y cols. Diversidad de Bacillus anthracis y potencial geográfico en Nigeria, Camerún y Chad: mayor apoyo a un nuevo linaje de África occidental. PLoS Negl. tropo. Dis. 9, e0003931 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Zincke, D., Norris, MH, Kurmanov, B., Hadfield, TL y Blackburn, JK Ensayo de polimorfismo de nucleótidos para la identificación del grupo de África occidental Bacillus anthracis: un linaje que carece de antrosa. BMC Microbiol. 20, 6 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coté, CK et al. La detección del antígeno protector (PA) asociado con esporas de Bacillus anthracis y los efectos de los anticuerpos anti-PA sobre la germinación de esporas y las interacciones de macrófagos. Microbio. Pato. 38, 209–225 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Clark, A. & Wolfe, DN Estado actual de las vacunas contra el ántrax y lagunas clave en I+D en el futuro. Microorganismos 8, 418 (2020).

Artículo de Google Scholar

Turnbull, P. Estado actual de la inmunización contra el ántrax: es posible que las vacunas antiguas hayan llegado para quedarse por un tiempo. actual. Opinión. Infectar. Dis. 13, 113 (2000).

Artículo PubMed Google Scholar

Auerbach, S. & Wright, GG Estudios sobre inmunidad en el ántrax. VI. Actividad inmunizante del antígeno protector contra diversas cepas de Bacillus anthracis. J Immunol 75, 129–33 (1955).

Charlton, S. y col. Un estudio de la fisiología de Bacillus anthracis Sterne durante la fabricación de la vacuna acelular contra el ántrax en el Reino Unido. J. Aplica. Microbiol. 103, 1453-1460 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Modi, T. y col. Caracterización de la vacuna contra el ántrax del Reino Unido y su inmunogenicidad humana. Tararear. Vacunas Inmunotras. 9, 1-12 (2020).

Google Académico

Ghosh, A. et al. Las proteínas codificadas por el operón gerP se localizan en la capa interna de las esporas de Bacillus cereus y dependen de GerPA y SafA para su ensamblaje. Aplica. Reinar. Microbiol. 84, e00760-e818 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuwana, R. y col. Caracterización proteómica de nuevas proteínas de esporas de Bacillus subtilis. Microbiología 148, 3971–3982 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Korza, G. y col. Análisis de los ARNm en esporas de Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 201, e00007-19 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carr, KA, Lybarger, SR, Anderson, EC, Janes, BK y Hanna, PC El papel de los receptores germinantes de Bacillus anthracis en la germinación y la virulencia. Mol. Microbiol. 75, 365–375 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Titball, R. & Manchee, R. Factores que afectan la germinación de esporas de Bacillus anthracis. J. Aplica. Microbiol. 62, 269–273 (1987).

CAS Google Académico

Barlass, PJ, Houston, CW, Clements, MO y Moir, A. Germinación de esporas de Bacillus cereus en respuesta a la L-alanina y la inosina: las funciones de los operones gerL y gerQ. Microbiología (Reading, Engl.) 148, 2089–2095 (2002).

Shigeo, T., Kazutake, H. y Yasutaro, F. La expresión de kinA y kinB de Bacillus subtilis, necesarios para el inicio de la esporulación, está bajo un estricto control de transcripción positivo. J. Bacteriol. 195, 1656-1665 (2013).

Artículo de Google Scholar

Mitani, T., Heinze, JE y Freese, E. Inducción de la esporulación en Bacillus subtilis mediante decoyinina o hadacidina. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 77, 1118-1125 (1977).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ratnayake-Lecamwasam, M., Serror, P., Wong, K.-W. & Sonenshein, AL Bacillus subtilis CodY reprime genes de fase estacionaria temprana al detectar niveles de GTP. Desarrollo de genes. 15, 1093-1103 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steil, L., Serrano, M., Henriques, AO & Völker, U. Análisis de todo el genoma de la expresión genética regulada temporalmente y específica del compartimento en células esporuladas de Bacillus subtilis. Microbiología 151, 399–420 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Irnov, I., Sharma, CM, Vogel, J. y Winkler, WC Identificación de ARN reguladores en Bacillus subtilis. Ácidos nucleicos Res 38, 6637–6651 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Min, K.-T., Hilditch, CM, Diederich, B., Errington, J. y Yudkin, MD σF, el primer factor de transcripción específico del compartimento de B. subtilis, está regulado por un factor anti-σ que también está una proteína quinasa. Celda 74, 735–742 (1993).

Joon, S. y col. Caracterización bioquímica de la proteína sensora de GTP, CodY de Bacillus anthracis. Patógenos Dis. 75, ftx048 (2017).

Dale, JL, Raynor, MJ, Ty, MC, Hadjifrangiskou, M. & Koehler, TM Una doble función para el regulador maestro de virulencia de Bacillus anthracis, AtxA: control de la esporulación y la producción de toxina del ántrax. Frente Microbiol 9, 58 (2018).

Artículo de Google Scholar

Saile, E. & Koehler, TM Control de la expresión del gen de la toxina del ántrax mediante el regulador del estado de transición abrB. J. Bacteriol. 184, 370–380 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uchida, I., Makino, S., Sekizaki, T. y Terakado, N. Interacción con los genes para la síntesis de la cápsula de Bacillus anthracis mediante atxA, el gen que codifica el activador trans de la síntesis de la toxina del ántrax. Mol. Microbiol. 23, 1229-1240 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Drysdale, M., Bourgogne, A., Hilsenbeck, SG y Koehler, TM atxA Controla la síntesis de la cápsula de Bacillus anthracis mediante acpA y un regulador recientemente descubierto, acpB. J. Bacteriol. 186, 307–315 (2004).

Drysdale, M., Bourgogne, A. y Koehler, TM Análisis transcripcional de los reguladores de la cápsula de Bacillus anthracis. J. Bacteriol, 187, 5108–5114 (2005).

Kubler-Kielb, J. et al. Los sacáridos tienen reacción cruzada con la glicoproteína de esporas de Bacillus anthracis como componente de la vacuna contra el ántrax. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 105, 8709–8712 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. y Durbin, R. Alineación de lectura corta rápida y precisa con la transformada de Burrows-Wheeler. Bioinformática 25, 1754-1760 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Robinson, JT y cols. Visor de genómica integrativa. Nat. Biotecnología. 29, 24-26 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. y Usadel, B. Trimmomatic: un recortador flexible para datos de secuencia de Illumina. Bioinformática 30, 2114-2120 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bankevich, A. y cols. SPAdes: un nuevo algoritmo de ensamblaje del genoma y sus aplicaciones a la secuenciación unicelular. J. Computación. Biol. 19, 455–477 (2012).

Artículo MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walker, BJ y cols. Pilon: una herramienta integrada para la detección integral de variantes microbianas y la mejora del ensamblaje del genoma. PLoS One 9, 148 (2014).

Artículo de Google Scholar

Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N. y Tesler, G. QUAST: herramienta de evaluación de la calidad para ensamblajes de genomas. Bioinformática 29, 1072–1075 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, P.-E. et al. Permitir la democratización de la revolución genómica con una plataforma bioinformática basada en web totalmente integrada. Ácidos nucleicos res. 45, 67–80 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Shakya, M. y col. Análisis evolutivo filogenético y molecular estandarizado aplicado a especies en todo el árbol de la vida microbiano. Ciencia. Rep. 10, 1723 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v4: actualizaciones recientes y nuevos desarrollos. Ácidos nucleicos res. 47, W256–W259 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

López, CM, Rholl, DA, Trunck, LA y Schweizer, HP Sistema versátil de doble tecnología para el reemplazo de alelos sin marcadores en Burkholderia pseudomallei. Aplica. Reinar. Microbiol. 75, 6496–6503 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Norris, MH, Kang, Y., Wilcox, B. y Hoang, TT Construcciones de etiquetado fluorescente estables y específicas del sitio optimizadas para especies de Burkholderia. Aplica. Reinar. Microbiol. 76, 7635–7640 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramanian, V. et al. La deficiencia de ADN helicasa del síndrome de Bloom se asocia con estrés oxidativo y cambios en la red mitocondrial. Ciencia. Rep. 11, 2157 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schindelin, J. y col. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Nat. Métodos 9, 676–682 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Aranda, PS, LaJoie, DM y Jorcyk, CL Gel blanqueador: un gel de agarosa simple para analizar la calidad del ARN. Electroforesis 33, 366–369 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olson, RD y cols. Presentamos el Centro de recursos de bioinformática viral y bacteriana (BV-BRC): un recurso que combina PATRIC, IRD y ViPR. Ácidos nucleicos res. 51, D678–D689 (2023).

Artículo PubMed Google Scholar

Davis, JJ y cols. El centro de recursos de bioinformática PATRIC: ampliación de las capacidades de análisis y datos. Ácidos nucleicos res. 48, D606–D612 (2020).

CAS PubMed Google Académico

Trapnell, C. y col. Análisis diferencial de expresión de genes y transcripciones de experimentos de RNA-seq con TopHat y Cufflinks. Nat. Protocolo. 7, 562–578 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Szklarczyk, D. y col. STRING v11: Redes de asociación proteína-proteína con mayor cobertura, que respaldan el descubrimiento funcional en conjuntos de datos experimentales de todo el genoma. Ácidos nucleicos res. 47, D607–D613 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Plaut, RD y Stibitz, S. Mejoras en un sistema de intercambio alélico sin marcadores para Bacillus anthracis. MÁS UNO 10, e0142758 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Norris, MH & Blackburn, JK Vinculación de las ciencias geoespaciales y de laboratorio para definir los mecanismos detrás de los impulsores de los brotes de ántrax a nivel de paisaje. En t. J. Medio Ambiente. Res. Salud Pública 16, 3747 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andreu, N. et al. Optimización de reporteros bioluminiscentes para uso con Mycobacterias. MÁS UNO 5, e10777 (2010).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Este trabajo fue apoyado por el premio DTRA STNI HDTRA121C0033 para MHN. Agradecemos la asistencia técnica de Nicole J. Machi en el Núcleo de Microscopía Electrónica ICBR de la UF.

Laboratorio de Investigación de Epidemiología Espacial y Ecología, Departamento de Geografía, Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Michael H. Norris, Andrew P. Bluhm, Morgan C. Machine Gunner, representante de Treenate, Ted Hadfield y Jason K. Blackburn

Instituto de Patógenos Emergentes, Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Michael H. Norris, Andrew P. Bluhm, Morgan C. Machine Gunner, representante de Treenate, Ted Hadfield y Jason K. Blackburn

Departamento de Ciencias de la Salud de la Población, Facultad de Salud Pública, Universidad Estatal de Georgia, Atlanta, GA, EE. UU.

Alejandro Kirpich

Departamento de Biología, Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE. UU.

Jose Miguel Ponciano

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MHN concibió los experimentos, MHN, APB, MCM y TJ realizaron los experimentos, y MHN, AK, TH, JMP y JKB analizaron los resultados. MHN escribió el borrador original y todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Michael H. Norris.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Norris, MH, Bluhm, AP, Metrailer, MC y col. Más allá de la espora, la antrosa de azúcar del exosporio afecta la regulación del gen vegetativo del Bacillus anthracis en cis y trans. Representante científico 13, 5060 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32162-x

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Recibido: 19 de enero de 2023

Aceptado: 23 de marzo de 2023

Publicado: 28 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32162-x

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